انقسام الشبكية كتحضير مسطح محسن لدراسة الخلايا العصبية للطبقة النووية الداخلية في شبكية الفقاريات
Summary
يقدم هذا العمل إعدادا بديلا لشبكية العين المسطحة حيث تتيح إزالة أجسام الخلايا المستقبلة للضوء انتشارا أسرع للأجسام المضادة وتحسين وصول ماصة التصحيح إلى الخلايا العصبية الداخلية للشبكية للكيمياء المناعية والتهجين في الموقع وتجارب الفيزيولوجيا الكهربية.
Abstract
الخلايا ثنائية القطب والخلايا الأفقية لشبكية الفقاريات هي الخلايا العصبية الأولى التي تعالج المعلومات البصرية بعد اكتشاف الفوتونات بواسطة المستقبلات الضوئية. يؤدون عمليات أساسية مثل التكيف مع الضوء وحساسية التباين والتوافق المكاني واللوني. إن الفهم الكامل للدوائر الدقيقة والآليات الكيميائية الحيوية التي تحكم سلوكهم سيعزز أبحاث علم الأعصاب البصري وطب العيون. ومع ذلك ، فإن الاستعدادات الحالية لفحص الخلايا ثنائية القطب والأفقية (حوامل شبكية العين الكاملة والشرائح الرأسية) محدودة في قدرتها على التقاط تشريح وفسيولوجيا هذه الخلايا. في هذا العمل ، نقدم طريقة لإزالة أجسام الخلايا المستقبلة للضوء من شبكية فأر حية مسطحة ، مما يوفر وصولا معززا إلى الخلايا ثنائية القطب والأفقية من أجل تثبيت التصحيح بكفاءة ووضع العلامات المناعية السريعة. يتم تحضير شبكية العين المنقسمة عن طريق وضع شبكية فأر معزولة بين قطعتين من النيتروسليلوز ، ثم تقشيرها برفق. يقسم الفصل الشبكية فوق الطبقة الضفيرية الخارجية مباشرة لإنتاج قطعتين من النيتروسليلوز ، واحدة تحتوي على أجسام الخلايا المستقبلة للضوء والأخرى تحتوي على الشبكية الداخلية المتبقية. على عكس شرائح الشبكية الرأسية ، فإن تحضير الشبكية المنقسمة لا يقطع العمليات المتغصنة للخلايا العصبية الداخلية للشبكية ، مما يسمح بالتسجيلات من الخلايا ثنائية القطب والأفقية التي تدمج مساهمات الشبكات المقترنة بتقاطع الفجوة وخلايا الأمكرين واسعة المجال. يوضح هذا العمل براعة هذا التحضير لدراسة الخلايا الأفقية وثنائية القطب في الفيزيولوجيا الكهربية والكيمياء الهيستولوجية المناعية وتجارب التهجين في الموقع .
Introduction
شبكية العين هي نسيج عصبي رقيق يقع في العين الخلفية حيث يتم اعتراض الضوء ومعالجته في إشارة كهروكيميائية يمكن تفسيرها من قبل الدماغ. في الجزء الخلفي من شبكية العين ، يتم تحفيز المستقبلات الضوئية للقضيب والمخروط عن طريق الضوء ، مما يقلل من معدل إطلاق منشط الناقل العصبي ، الغلوتامات1. أول الخلايا العصبية التي تختبر وتستجيب لهذا التغيير الناجم عن الضوء في تركيز الغلوتامات هي الخلايا ثنائية القطب (BCs) والخلايا الأفقية (HCs) ، التي توجد سوماتها في المنطقة الخارجية من الطبقة النووية الداخلية (INL). تؤدي هذه الخلايا العصبية من الدرجة الثانية المرحلة الأولى من معالجة الإشارات في شبكية العين وتشكل السمات الحرجة للرؤية مثل التكيف مع الضوء وحساسية التباين والمقابلة المكانية / اللونية2. في حين أن هذه الوظائف قد نسبت إلى BCs و HCs ، فإن الدوائر والآليات الكيميائية الحيوية الكامنة وراء هذه العمليات ليست مفهومة تماما3. لذلك ، فإن تطوير الأدوات والأساليب لاستكشاف فسيولوجيا BC و HC له أهمية قصوى.
أثبتت أقسام شبكية العين الرأسية (المستعرضة) منذ فترة طويلة أنها النموذج الأكثر عملية لدراسة BCs و HCs. ومع ذلك ، لا يمكن الوصول إلى جوانب معينة من فسيولوجيا BC و HC للمجرب بموجب هذا النموذج. لا تعكس التسجيلات المباشرة من HCs أو القياسات غير المباشرة لآثارها على BCs الاتصال الداخلي لشبكية العين حيث يتم قطع العمليات الجانبية لهذه الخلايا أثناء التقطيع. تتحايل مستحضرات شبكية العين الكاملة على هذه المشكلة من خلال الحفاظ على هذه العمليات الجانبية ، لكن طبقات الشبكية المحيطة تشكل تحديا للوصول إلى هذه الخلايا4. في حين أن هناك أمثلة وفيرة على التلوين المناعي5،6،7،8 وتسجيلات المشبكالتصحيح 9 من الخلايا العصبية INL في شبكية العين بأكملها ، هناك فرصة لتسريع وتبسيط جمع هذه البيانات. وبالتالي ، فإن القيود المتأصلة في المقاطع المستعرضة وتحديات نموذج التركيب بأكمله ألهمت تطوير هذا التحضير البديل لشبكية العين المسطحة.
يصف العمل التالي بروتوكولا لإزالة طبقة المستقبلات الضوئية بسهولة من شبكية العين الحية المسطحة لتعزيز الوصول إلى BCs و HCs من أجل لقط رقعة مبسط ووضع العلامات المناعية بشكل أسرع وأكثر كفاءة. يؤدي تقشير قطعتين من غشاء النيتروسليلوز المتصلين بجانبي الشبكية المعزولة إلى تمزيق الأنسجة من خلال محاور مستقبلات الضوء ، تاركا شبكية منقسمة تحتفظ بالطبقة الضفيرية الخارجية (OPL) وجميع طبقات الشبكية الداخلية. بينما وصف آخرون بروتوكولات لفصل طبقات شبكية العين ميكانيكيا ، فإن هذه الطرق إما غير مناسبة لتطبيقات التثبيت والفحص المجهري أو تتطلب معالجة مملة للأنسجة. تتطلب العديد من هذه الطرق أنسجة مجمدة أو مجففة بالتجميد لفصل الطبقة ، مما يجعلها غير متوافقة مع تجارب الفيزيولوجيا الكهربية10،11،12. تم تصميم البعض الآخر للأنسجة الحية ، ولكنه يتطلب 5-15 تقشيرا متتابعا باستخدام ورق الترشيح4،11 أو العلاج بالتربسين13 لإزالة المستقبلات الضوئية. تعمل التقنية الموصوفة هنا على تحسين سابقاتها من خلال تبسيط إجراء إزالة المستقبلات الضوئية وتوسيع ذخيرة التطبيقات النهائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
بعد أن تقوم المستقبلات الضوئية بتحويل امتصاص الفوتون إلى إطلاق ناقل عصبي ، تعد BCs و HCs أول خلايا عصبية في شبكية العين تعالج الإشارة البصرية23. في حين أن أهمية هذه الخلايا العصبية تحظى بتقدير كبير ، فإن العديد من وظائفها غير مفهومة بشكل كامل أو غير مستكشفة تماما. من المحتمل أن تستفيد العديد من دراسات علم وظائف الأعضاء BC و HC من إعداد شبكية العين المسطح الذي يحسن الوصول إلى الخلايا العصبية INL مع الحفاظ على الاتصال الجانبي. يمثل تطوير طريقة تقسيم الشبكية جهدا لتوفير بروتوكول سهل للحصول على تسجيلات فيزيولوجية كهربية عالية الجودة وبيانات مجهرية من BCs و HCs في اتجاه مسطح. يمكن إجراء تحضير الشبكية المنقسمة الموصوف هنا في حوالي 20 دقيقة لكل فأر (10 دقائق لكل شبكية) بعد عزل الشبكية ، دون استخدام معدات متخصصة. تستمد الطريقة الإلهام من إجراءات إزالة المستقبلات الضوئية الحالية ولكنها تقدم تحسينات كبيرة في البساطة والسرعة والتنوع4،10،11،12،13. على عكس الطرق السابقة لفصل طبقات الشبكية ، لا يتطلب تقسيم الشبكية التجميد أو التجفيد أو التطبيق المتكرر للمواد اللاصقة على شبكية العين. مع الممارسة ، يمكن إزالة جميع المستقبلات الضوئية تقريبا في تمزق واحد باستخدام غشاء النيتروسليلوز. تسمح سرعة وسهولة هذا النهج للمرء بتقليل الوقت الذي تقضيه شبكية العين خارج Ames الكربوجينية ، مما يتيح بقاء الخلايا العالية لفترات طويلة. يمكن الحفاظ على شبكية العين المنقسمة في وسائط أميس الكربوجينية لعدة ساعات بعد الانقسام. كدليل على صحة الخلايا العصبية INL في هذا المستحضر ، تؤكد بقعة الخلايا الحية / الميتة (الشكل 4) والفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح (الشكل 6) صلاحية كرات الدم الحمراء و HCs بعد الانقسام.
إن إزالة طبقة المستقبلات الضوئية في شبكية العين المنقسمة تنقل ميزة كبيرة أثناء وضع العلامات المناعية عن طريق تقليل وقت انتشار الأجسام المضادة في INL بشكل كبير. يمكن إكمال وضع العلامات على الأجسام المضادة الأولية والثانوية في غضون 2 ساعة ، وهو تحسن كبير في تلطيخ التثبيت المسطح التقليدي الذي يمكن أن يستغرق 72 ساعة أو أكثر اعتمادا على الهدف5،6،7،8،20،22. نتيجة لذلك ، يمكن الحصول على بيانات الفحص المجهري في نفس يوم تحضير الأنسجة ، مما يسرع بشكل كبير من وتيرة تجارب التألق المناعي. لتسهيل تلدين مسبار mRNA ، توصي تجارب FISH عادة بأوقات تثبيت أطول بكثير (~ 24 ساعة) من وضع العلامات المناعية18. ومع ذلك ، توضح التجارب المقدمة هنا أن التثبيت لمدة 2 ساعة لا يزال ينتج ملصقات FISH استثنائية (الشكل 5). على الرغم من تمديد وقت التثبيت من 30 دقيقة إلى 2 ساعة ، لم يكن من الضروري إجراء خطوات استرجاع المستضد للحصول على علامات مناعية ممتازة ، ولكن هذا قد يختلف مع الجسم المضاد أو المستضد. قد يتداخل علاج الأنزيم البروتيني في بروتوكول FISH مع وضع العلامات على الأجسام المضادة ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى تدمير الحواتم المستهدفة. تم التحايل على هذه المشكلة باستخدام الأجسام المضادة متعددة النسيلة التي تستهدف حواتم متعددة ، مما يقلل من احتمال أن يؤدي تدمير الحواتم إلى إعاقة وضع العلامات المناعية. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام علاج البروتياز المعتدل (ACD protease III) لمنع التغيير المفرط في الحاتم مع توفير اختراق كاف للأنسجة.
في بعض الأحيان ، تنقسم شبكية العين بدلا من ذلك عبر الطبقة النووية الخارجية (ONL) ، تاركة وراءها طبقات من الأورام المستقبلة للضوء مع عدم وجود خلايا INL مرئية. لمنع ذلك ، يجب على المرء التأكد من أن شبكية العين مسطحة تماما على الزجاج ، وأن أي سائل متبقي من حول الشبكية قد تمت إزالته. قد يساعد الضغط بقوة أكبر على النيتروسليلوز باستخدام فرشاة الرسم أيضا في منع الانقسام من خلال ONL. إذا أصبح الغشاء رطبا جدا أو تم طي الشبكية على نفسها ، فإن فرص الانقسام الناجح ستتضاءل بشكل كبير. يعد استخدام DAPI لتلطيخ نوى الخلايا مفيدا لتقييم جودة الانقسام وتحديد تغطية المستقبلات الضوئية المتبقية. تكون نوى المستقبلات الضوئية أصغر حجما وأكثر إشراقا وسطحية (الشكل التكميلي 3 أ) ، في حين أن نوى BC أكبر وأكثر خفوتا وأعمق (الشكل التكميلي 3 ب). في بعض الحالات ، يختلف مستوى التمزق قليلا عبر قطعة الشبكية ، مما يؤدي إلى ظهور بقع حيث لم تتم إزالة أجسام خلايا المستقبلات الضوئية بالكامل (الشكل التكميلي 3C). بالنسبة للتطبيقات في الفحص المجهري والفيزيولوجيا الكهربية ، فإن هذا لا يعيق القدرة على جمع بيانات عالية الجودة من المناطق التي تمت فيها إزالة المستقبلات الضوئية بشكل صحيح ؛ يمكن بسهولة العثور على مجالات كبيرة من شبكية العين الداخلية المكشوفة عند التصوير أو التسجيل باستخدام ماصة رقعة. إذا كانت هناك رغبة في إزالة مستقبلات ضوئية أكثر اكتمالا ، فيمكن إجراء تمزق ثان بقطعة إضافية من غشاء النيتروسليلوز ، على الرغم من أن إزالة المستقبلات الضوئية بنسبة 100٪ غير مضمونة. لذلك ينصح بالحذر عند استخدام شبكية العين المنقسمة في دراسات التعبير الجيني أو البروتينات حيث يمكن أن تؤثر المواد المستقبلة للضوء المتبقية على النتائج. بالنسبة لتطبيقات الخلية الواحدة ، لا مبرر لهذا القلق ، حيث يمكن استبعاد البيانات من المستقبلات الضوئية من التحليل.
ربما تكون مزايا تحضير الشبكية المنقسمة أكثر بروزا في التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية للخلايا العصبية البينية واسعة المجال. في حين أن الشرائح الرأسية التقليدية تقطع العمليات الواسعة للخلايا واسعة المجال ، فإن تحضير شبكية العين المنقسمة يترك OPL و IPL سليمين ، مما يسمح للمرء بالتقاط المدخلات من الخلايا واسعة المجال مثل HCs 24 و A17s25 و TH ACs 26 و NOS-1 ACs27 التي يمكن تجاهلها في شرائح عمودية. لذلك ، يتطلب تفسير النتائج والمقارنة مع البيانات السابقة التي تم جمعها من شرائح الشبكية تفكيرا دقيقا. ومع ذلك ، في التجارب التي تستخدم المحاكاة الدوائية لتحفيز الضوء ، تشبه هذه النتائج البيانات المسجلة من شرائح الشبكية19. من خلال التعبير عن ChR2 تحت المروجين الخاصين بالخلية ، يمكن للمرء تحفيز عدد الخلايا المرغوب فيه أثناء التسجيل من BCs في INL للتحقيق في تأثير الخلية المطلوبة على مسار المعلومات العمودي. التسجيل مباشرة من الخلايا العصبية INL العميقة ، مثل خلايا amacrine ، ممكن أيضا في شبكية العين المنقسمة. بينما في هذه الحالة يجب أن ينتقل قطب التصحيح أولا عبر الخلايا العصبية INL الأكثر سطحية ، إلا أن هناك أنسجة أقل بكثير تعيق مسارها عند مقارنتها بإعداد التثبيت الكامل التقليدي.
بالإضافة إلى قياس تأثير الخلايا واسعة المجال على الخلايا العصبية الأخرى ، تتيح هذه الطريقة التثبيت المباشر لرقعة الخلية الواحدة من HCs ، التي تشكل الزوائد الشجيرية شبكة مقترنة واسعة النطاق في OPL28. ترسل الخلايا الأفقية ردود فعل مهمة إلى المستقبلات الضوئية التي تشكل نقل المعلومات الرأسية عبر شبكية العين. ومع ذلك ، نظرا لأن الحقول المتغصنة ل HCs يتم اقتطاعها في شرائح رأسية ، فإن بيانات تسجيل الخلية المفردة غير متوفرة. يقدم هذا العمل HCs سليمة تشريحيا وفسيولوجيا يتم تسجيل التيارات المستثارة ChR2 منها في خط فأر معدل وراثيا ثلاثي (الشكل 6 C-E). خارج تحفيز ChR2 ، يمكن استخدام الشبكية المنقسمة لدراسة تيارات HC الداخلية واقتران تقاطع الفجوة28. بينما توفر شبكية العين المنقسمة نموذجا مناسبا لدراسة الاتصال المشبكي والنشاط العصبي الناجم عن التطبيق الكيميائي أو تحفيز ChR2 ، فإن نقص المستقبلات الضوئية يحول دون أي استكشاف مباشر لاستجابات الضوء الطبيعي أو آليات التكيف مع الضوء.
حقق التصوير في الموقع في شبكية العين تقدما مثيرا للإعجاب في السنوات الأخيرة. ومع ذلك ، فإن غالبية دراسات التصوير تقتصر على طبقة الخلايا العقدية في مستحضرات شبكية العين الكاملة29. يتصور المؤلفون أن غياب المستقبلات الضوئية في شبكية العين المنقسمة سيجعلها نموذجا مثاليا لتصوير الكالسيوم الحي في OPL و INL. بالإضافة إلى تصوير الكالسيوم ، يتمتع هذا النموذج بإمكانية كبيرة للاستخدام مع أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا مثل iGluSnFR 30,31 و iGABASnFR32 و pHluorin 33. إلى جانب تحضير الشبكية المنقسمة ، قد توفر هذه الأدوات القوية نهجا فعالا لاستكشاف التفاعلات المشبكية والخصائص الفيزيائية الحيوية ل BCs و HCs التي تساهم في معالجة الضوء في شبكية العين.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة التالية: منحة المعاهد الوطنية للصحة R01EY031596 (إلى C.M.) ؛ منحة المعاهد الوطنية للصحة R01EY029985 (إلى C.M.) ؛ منحة المعاهد الوطنية للصحة P30EY010572 (إلى C.M.) ؛ منحة المعاهد الوطنية للصحة R01EY032564 (إلى BS). نشكر تامي هالي على دعمها الفني في إعداد أقسام شبكية العين ، والدكتور تشارلز ألين لمساهمته السخية في مجسات mRNA FISH المستخدمة في هذا العمل.
Materials
| #1.5 glass coverslips | Fisherbrand | 12544E | |
| 2 pairs of Dumont #5 forceps | Ted Pella | 38125 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickenson | 305122 | |
| 470 nm LED | THORLABS | M470L2 | |
| 5-306 curved scissors | Miltex | 5-306 | |
| 9" disposable pasteur pipetes | Fisherbrand | 13-678-20D | for constructing custom transfer pipette |
| Ai80d mouse | Jackson Laboratories | 25109 | RRID: IMSR_JAX:025109 |
| Ames Medium w/L-Glutamate | US Biological | A1372-25 | |
| amplifier control software | Molecular Devices | Clampex 10.3 software | |
| anti-calbindin D28K antibody | Invitrogen | PA-5 85669 | RRID: AB_2792808, host species = rabbit; 1:100 dilution |
| anti-CtBP2 antibody | BD Biosciences | 612044 | RRID: AB_399431, host species = mouse; 1:5000 dilution |
| anti-GPR179 antibody | NA | NA | gift from Kirill Martemyanov; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; host species = sheep; 1:1000 dilution |
| anti-PKC alpha antibody | Sigma-Aldrich | P4334 | RRID: AB_477345, host species = rabbit; 1:5000 dilution |
| anti-PKC alpha antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc8393 AF594 | RRID: AB_628142, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| anti-PSD95 antibody | BD Transduction Laboratories | 610495 | RRID: AB_397862, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| anti-RGS11 antibody | NA | NA | gift from Ted Wensel; Baylor College of Medicine, Houston, TX; host species = rabbit; between 1:1000 and 1:5000 dilution |
| anti-Synaptophysin P38 antibody | Sigma | S-S5768 | RRID: AB_477523, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| Aquamount mounting media | Epredia | 13800 | slide mounting media |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratories | 000664 | RRID: IMSR_JAX:000664 |
| carbogen tank | Matheson | NA | 95% O2 and 5% CO2 |
| custom transfer pipette | custom build | NA | Instructions: use scissors to cut off the tip of a plasitc transfer pipette at the point it begins to taper. Use pliers to safely break off the last 2-3 inches of a glass pasteur pipette. Fit the narrow end of the glass pasteur pipette into the wide tip of the plastic transfer pipete. Wrap parafilm around the joint of the two pieces to enhance the seal. |
| Digitical optical power meter | THORLABS | PM100D | |
| dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| electrophysiology amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| electrophysiology microscope | Olympus | OLYMPUS, BX50WI | Dodt gradient contrast microscopy |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HC PL APO CS2 40x/1.3 | Leica | 506358 | |
| HC PL APO CS2 63x/1.40 | Leica | 15506350 | |
| Hybridization oven | Robbins Scientific | Model 1000 | for RNAscope protocol only |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| isoflurane | Piramal Critical Care | 66794-017-25 | |
| Kimwipe (delicate task wipe) | Kimtech Science | 34155 | |
| Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 oil immersion objective | Leica | 506358 | |
| Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 oil immersion objective | Leica | 15506350 | |
| Leica TCS SP8 X confocal microscope | Leica | discontinued | |
| medium 15 mm petri dish | Corning | 25060-60 | eyes are kept here during retina dissection |
| Merit 97-275 steel scissors | Merit | 97-275 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | p-97 | |
| Mm-Gabrd-C2 mRNA probe | ACD | 459481-C2 | |
| mouse euthanasia chamber | NA | NA | custom build; glass petri dish covering a small glass jar. |
| nitrocellulose membrane filters | GE Healthcare Life Sciences; Whatman | 7184-005 | 0.45 µm pore size |
| Picospritzer | General Valve Corporation | Picospritzer II | referred to in the text as microcellular injection unit |
| plastic transfer pipets | Fisherbrand | 13-711-7M | for constructing custom transfer pipette |
| Plastic tubing | Tygon | R-603 | for connection to carbogen tank |
| platinum harp | custom build | NA | for anchoring split retinas within the electrophysiology recording chamber. |
| size 0 paint brush | generic | NA | for flattening retina during splitting. |
| SlowFade Gold antifade reagent | Molecular Probes | S36937 | referred to in the text as anti-fade mounting media |
| small 10 mm petri dish | Falcon | 353001 | eyes are placed here following enucleation |
| small glass pane (7.5 cm x 5 cm) | generic | NA | isolatd retina pieces are placed onto this for the splitting procedure |
| Superfrost plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | electrostatically-charged glass microscope slides |
| Thick-walled borosilicate glass pipettes with filament | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | |
| Vannas Scissors; straight | Titan Medical | TMS121 | not brand specific; any comparable scissors will work |
| vGATFLPo mouse | Jackson Laboratories | 29591 | RRID: IMSR_JAX:029591 |
| vGlut2Cre mouse | Jackson Laboratories | 28863, 016963 | RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963 |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | BioLegend | 423105 | referred to in the text as MI-NIR |
References
- Morgans, C. W. Neurotransmitter release at ribbon synapses in the retina. Immunology & Cell Biology. 78 (4), 442-446 (2000).
- Euler, T., Haverkamp, S., Schubert, T., Baden, T. Retinal bipolar cells: elementary building blocks of vision. Nature Reviews Neuroscience. 15 (8), 507-519 (2014).
- Barnes, S., Grove, J. C. R., McHugh, C. F., Hirano, A. A., Brecha, N. C. Horizontal Cell Feedback to Cone Photoreceptors in Mammalian Retina: Novel Insights From the GABA-pH Hybrid Model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).
- Walston, S. T., Chang, Y. C., Weiland, J. D., Chow, R. H. Method to remove photoreceptors from whole mount retina in vitro. Journal of Neurophysiology. 118 (5), 2763-2769 (2017).
- Stefanov, A., Novelli, E., Strettoi, E. Inner retinal preservation in the photoinducible I307N rhodopsin mutant mouse, a model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Comparative Neurology. 528 (9), 1502-1522 (2020).
- Matsuoka, R. L., Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Parray, A., Badea, T. C., Chédotal, A., Kolodkin, A. L. Transmembrane semaphorin signaling controls laminar stratification in the mammalian retina. Nature. 470 (7333), 259-263 (2011).
- Matsuoka, R. L., et al. Guidance-Cue Control of Horizontal Cell Morphology, Lamination, and Synapse Formation in the Mammalian Outer Retina. Journal of Neuroscience. 32 (20), 6859-6868 (2012).
- Wässle, H., Puller, C., Müller, F., Haverkamp, S. Cone Contacts, Mosaics, and Territories of Bipolar Cells in the Mouse Retina. Journal of Neuroscience. 29 (1), 106-117 (2009).
- Thoreson, W. B., Dacey, D. M. Diverse Cell Types, Circuits, and Mechanisms for Color Vision in the Vertebrate Retina. Physiological Reviews. 99 (3), 1527-1573 (2019).
- Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
- Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
- Todorova, V., et al. Retinal Layer Separation (ReLayS) method enables the molecular analysis of photoreceptor segments and cell bodies, as well as the inner retina. Scientific Reports. 12 (1), 20195 (2022).
- Shiosaka, S., Kiyama, H., Tohyama, M. A simple method for the separation of retinal sublayers from the entire retina with special reference to application for cell culture. Journal of Neuroscience Methods. 10 (3), 229-235 (1984).
- Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre-recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
- Sarria, I., Orlandi, C., McCall, M. A., Gregg, R. G., Martemyanov, K. A. Intermolecular Interaction between Anchoring Subunits Specify Subcellular Targeting and Function of RGS Proteins in Retina ON-Bipolar Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (10), 2915-2925 (2016).
- Orlandi, C., Cao, Y., Martemyanov, K. A. Orphan Receptor GPR179 Forms Macromolecular Complexes With Components of Metabotropic Signaling Cascade in Retina ON-Bipolar Neurons. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 7153-7161 (2013).
- Dikshit, A., Zong, H., Anderson, C., Zhang, B., Ma, X. -. J. Simultaneous Visualization of RNA and Protein Expression in Tissue Using a Combined RNAscopeTM In Situ Hybridization and Immunofluorescence Protocol. Methods in Molecular Biology. 2148, 301-312 (2020).
- Wang, F., et al. RNAscope. The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Morgans, C. W., et al. TRPM1 is required for the depolarizing light response in retinal ON-bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19174-19178 (2009).
- Alessio, E., Zhang, D. Q. Immunostaining of whole-mount retinas with the CLARITY tissue clearing method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (7), 5054 (2020).
- Ferguson, L. R., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Grover, S., Chalam, K. V. Retinal Thickness Normative Data in Wild-Type Mice Using Customized Miniature SD-OCT. PLoS ONE. 8 (6), e67265 (2013).
- Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments JoVE. (82), e51018 (2013).
- Kolb, H. Neurotransmitters in the Retina. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Chaya, T., et al. Versatile functional roles of horizontal cells in the retinal circuit. Scientific Reports. 7 (1), 5540 (2017).
- Egger, V., Diamond, J. S. A17 Amacrine Cells and Olfactory Granule Cells: Parallel Processors of Early Sensory Information. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 600537 (2020).
- Dacey, D. M. The dopaminergic amacrine cell. The Journal of Comparative Neurology. 301 (3), 461-489 (1990).
- Park, S. J., et al. Connectomic analysis reveals an interneuron with an integral role in the retinal circuit for night vision. eLife. 9, 56077 (2020).
- Janssen-Bienhold, U., et al. Connexin57 is expressed in dendro-dendritic and axo-axonal gap junctions of mouse horizontal cells and its distribution is modulated by light. The Journal of Comparative Neurology. 513 (4), 363-374 (2009).
- Jain, V., et al. The functional organization of excitation and inhibition in the dendrites of mouse direction-selective ganglion cells. eLife. 9, 52949 (2020).
- Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).
- Strauss, S., et al. Center-surround interactions underlie bipolar cell motion sensitivity in the mouse retina. Nature Communications. 13 (1), 5574 (2022).
- Marvin, J. S., et al. A genetically encoded fluorescent sensor for in vivo imaging of GABA. Nature Methods. 16 (8), 763-770 (2019).
- Beckwith-Cohen, B., Holzhausen, L. C., Wang, T. M., Rajappa, R., Kramer, R. H. Localizing Proton-Mediated Inhibitory Feedback at the Retinal Horizontal Cell-Cone Synapse with Genetically-Encoded pH Probes. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (4), 651-662 (2019).
