יצירת אורגנואידים בכליות בתרחיף מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים
Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה מקיפה ויעילה לייצור אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות תנאי תרבית תרחיף. הדגש העיקרי של מחקר זה טמון בקביעת צפיפות התאים הראשונית וריכוז האגוניסט WNT, ובכך לטובת חוקרים המעוניינים במחקר אורגנואידים בכליות.
Abstract
אורגנואידים בכליות יכולים להיווצר מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות גישות שונות. אורגנואידים אלה טומנים בחובם הבטחה גדולה למידול מחלות, סינון תרופות ויישומים טיפוליים פוטנציאליים. מאמר זה מציג הליך שלב אחר שלב ליצירת אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), החל מהפס הפרימיטיבי האחורי (PS) ועד למזודרם הביניים (IM). הגישה מסתמכת על מדיום APEL 2, שהוא מדיום מוגדר ונטול רכיבים מן החי. הוא מתווסף עם ריכוז גבוה של אגוניסט WNT (CHIR99021) למשך 4 ימים, ואחריו גורם גדילה פיברובלסט 9 (FGF9)/הפרין וריכוז נמוך של CHIR99021 למשך 3 ימים נוספים. בתהליך זה, ניתן דגש לבחירת צפיפות התאים האופטימלית וריכוז CHIR99021 בתחילת תאי גזע פלוריפוטנטיים מוגנים, שכן גורמים אלה קריטיים לייצור מוצלח של אורגנואידים בכליות. היבט חשוב של פרוטוקול זה הוא תרבית ההשעיה בלוח הדבקה נמוך, המאפשר ל- IM להתפתח בהדרגה למבני נפרון, הכוללים מבנים צינוריים גלומרולריים, פרוקסימליים ודיסטליים, כולם מוצגים בפורמט מובן חזותית. בסך הכל, פרוטוקול מפורט זה מציע טכניקה יעילה וספציפית לייצור אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מגוונים, ומבטיח תוצאות מוצלחות ועקביות.
Introduction
לכליה תפקיד קריטי בשמירה על הומאוסטזיס פיזיולוגי, בהתאם ליחידה התפקודית שלה. נפרונים, המפרישים מוצרי פסולת, יכולים לווסת את הרכב נוזלי הגוף. מחלת כליות כרונית (CKD), הנגרמת על ידי מוטציות תורשתיות או גורמי סיכון גבוהים אחרים, תתקדם בסופו של דבר למחלת כליות סופנית (ESKD)1,2. ESKD נובע ככל הנראה מיכולת ההתחדשות המוגבלת של נפרונים. לפיכך, נדרש טיפול בתחליפי כליות. התמיינות מכוונת של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים מאפשרת יצירה חוץ גופית של אורגנואידים תלת-ממדיים ספציפיים למטופל, אשר יכולים לשמש לחקר התפתחות כליות, מודל מחלות ספציפיות למטופל וביצוע בדיקות סקר של תרופות נפרוטוקסיות 3,4.
במהלך ההתפתחות העוברית, הכליות מקורן במזודרם הביניים (IM), המבדיל מהפס הפרימיטיבי (PS). מסלול האיתות הקלאסי של WNT עשוי לגרום לבידול נוסף של IM עם השתתפות מתואמת של FGF (FGF9, FGF20) ו- BMP (איתות Bmp7 באמצעות JNK)5,6,7. הם מייצרים שתי אוכלוסיות תאים חשובות של תאי אב נפריים (NPC): ניצן השופכה (UB), והמזנכימה המטנפרית (MM), ויוצרים את צינורות האיסוף ואת הנפרון, בהתאמה 8,9. כל נפרון מורכב מקטעים גלומרולריים וצינוריים, כגון הצינוריות הפרוקסימליות והדיסטליות, והלולאה של הנלה10,11. על פי התיאוריה שהוזכרה לעיל, הפרוטוקולים המפורסמים כיום מחקים את מפל האותות ואת גירוי גורם הגדילה כדי לגרום לאורגנואידים בכליות 5,12.
במהלך השנים האחרונות, פרוטוקולים רבים פותחו כדי להבדיל iPSCs אנושיים לתוך אורגנואידים בכליות 5,6,7,12. Takasato et al.7 ייעל את משך הטיפול ב- CHIR (אגוניסט WNT) לפני החלפתו ב- FGF9. על פי הפרוטוקול שלהם, חשיפה ל- CHIR במשך 4 ימים, ואחריה FGF9 למשך 3 ימים, היא הדרך היעילה ביותר לגרום ל- IM מ- iPSCs. מסנני Transwell שימשו כפורמט התרבות בהליך שלהם; עם זאת, שיטה זו קשה למתחילים. לכן, קומאר ואחרים ניסו לשנות את פורמט התרבות ובחרו להשעות את התרבות. הם ניתקו את התאים הדבקים ביום השביעי לזריעה בלוחות דבקים נמוכים כדי לעזור להם להתאסף לגוף עוברי (EBs) המכילים מבנים דמויי נפרון. עם זאת, אפקט האצווה של שיטות אלה היה ברור, במיוחד iPSCs שונים. בנוסף, ספרות שונה דיווחה כי ריכוז CHIR נע בין 7 מיקרומטר ל 12 מיקרומטר 5,13,14.
שיערנו כי ריכוז צפיפות התאים וה-CHIR עשויים להשפיע על ייצור אורגנואידים בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שונים, וזה אומת פעמים רבות בניסויים שלנו. הפרוטוקול הנוכחי שינה מעט את שיטת המחקר של Kumar et al.13 וסיפק למשתמשים הליך שלב אחר שלב. לוח הזמנים והסכמה של הגישה מוצגים באיור 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול מפורט תואר ליצירת אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), הכולל שינויים קלים בתווך הבסיסי, צפיפות התאים הראשונית וריכוז CHIR99021. בניסויים שונים, הגורמים הקריטיים ליצירת אורגנואידים מוצלחים בכליות נמצאו כהתמיינות הראשונית של מזודרם הביניים (IM) ומצב התא ביום 7. יתר על …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה לכל חברי מאו והו לאב, בעבר ובהווה, על הדיונים המעניינים והתרומות הגדולות לפרויקט. אנו מודים למרכז המחקר הקליני הלאומי לבריאות הילד על התמיכה הגדולה. מחקר זה נתמך כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (U20A20351 לג’יאנהואה מאו, 82200784 ללידן הו), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג’ג’יאנג בסין (No. LQ22C070004 ללידן הו), והקרן למדעי הטבע של פרובינציית ג’יאנגסו (מענקים מס’. BK20210150 לגאנג וואנג).
Materials
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #o7920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease – a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765 (2016).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
- SaxOn, L., Sariola, H. Early organogenesis of the kidney. Pediatric Nephrology. 1, 385-392 (1987).
- Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
- Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
- Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361 (2019).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
