توليد عضويات الكلى في تعليق من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات
Summary
يقدم هذا البروتوكول طريقة شاملة وفعالة لإنتاج عضويات الكلى من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) باستخدام ظروف ثقافة التعليق. يكمن التركيز الأساسي لهذه الدراسة في تحديد كثافة الخلايا الأولية وتركيز ناهض WNT ، مما يفيد الباحثين المهتمين بأبحاث الكلى العضوية.
Abstract
يمكن توليد عضويات الكلى من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) من خلال طرق مختلفة. هذه المواد العضوية تحمل وعدا كبيرا لنمذجة الأمراض ، وفحص الأدوية ، والتطبيقات العلاجية المحتملة. تقدم هذه المقالة إجراء خطوة بخطوة لإنشاء عضويات الكلى من iPSCs ، بدءا من الخط البدائي الخلفي (PS) إلى الأديم المتوسط المتوسط المتوسط (IM). يعتمد النهج على وسيط APEL 2 ، وهو وسيط محدد خال من المكونات الحيوانية. يتم استكماله بتركيز عال من ناهض WNT (CHIR99021) لمدة 4 أيام ، يليه عامل نمو الخلايا الليفية 9 (FGF9) / الهيبارين وتركيز منخفض من CHIR99021 لمدة 3 أيام إضافية. خلال هذه العملية ، يتم التركيز على اختيار كثافة الخلايا المثلى وتركيز CHIR99021 في بداية iPSCs ، حيث أن هذه العوامل ضرورية لتوليد عضوي الكلى بنجاح. أحد الجوانب المهمة لهذا البروتوكول هو ثقافة التعليق في لوحة منخفضة الالتصاق ، مما يسمح لل IM بالتطور تدريجيا إلى هياكل نيفرون ، تشمل الهياكل الكبيبية والأنبوبية القريبة والأنبوبية البعيدة ، وكلها مقدمة بتنسيق مفهوم بصريا. بشكل عام ، يقدم هذا البروتوكول التفصيلي تقنية فعالة ومحددة لإنتاج عضويات الكلى من iPSCs المتنوعة ، مما يضمن نتائج ناجحة ومتسقة.
Introduction
تلعب الكلية دورا مهما في الحفاظ على التوازن الفسيولوجي ، اعتمادا على وحدتها الوظيفية. يمكن للنيفرون ، الذي يفرز الفضلات ، تنظيم تكوين سوائل الجسم. مرض الكلى المزمن (CKD) ، الناجم عن طفرات وراثية أو عوامل أخرى عالية الخطورة ، سيتقدم في النهاية إلى المرحلة النهائية من مرض الكلى (ESKD) 1,2. يبدو أن ESKD يرجع إلى قدرة التجديد المحدودة للنيفرون. وبالتالي ، مطلوب العلاج ببدائل الكلى. يتيح التمايز الموجه ل iPSCs البشرية الجيل في المختبر من عضويات الكلى ثلاثية الأبعاد الخاصة بالمريض ، والتي يمكن استخدامها لدراسة نمو الكلى ، ونمذجة الأمراض الخاصة بالمريض ، وإجراء فحص الأدوية السامة للكلية 3,4.
أثناء التطور الجنيني ، تنشأ الكلى من الأديم المتوسط المتوسط (IM) ، والذي يختلف عن الخط البدائي (PS). قد يؤدي مسار إشارات WNT الكلاسيكي إلى تمايز إضافي للمراسلة الفورية بمشاركة منسقة من FGF (FGF9 ، FGF20) و BMP (إشارات Bmp7 من خلال JNK) 5،6،7. أنها تنتج مجموعتين مهمتين من الخلايا السلفية الكلوية (NPC): برعم الحالب (UB) ، واللحمة المتوسطة metanephric (MM) ، وتشكيل القنوات الجامعة والنيفرون ،على التوالي 8,9. يتكون كل نفرون من شرائح كبيبية وأنبوبية ، مثل الأنابيب القريبة والبعيدة ، وحلقة Henle10,11. وفقا للنظرية المذكورة أعلاه ، تحاكي البروتوكولات المنشورة حاليا شلالات الإشارة وتحفيز عامل النمو للحث على عضويات الكلى 5,12.
على مدى السنوات العديدة الماضية ، تم تطوير العديد من البروتوكولات للتمييز بين iPSCs البشرية إلى عضويات الكلى5،6،7،12. قام Takasato et al.7 بتحسين مدة علاج CHIR (ناهض WNT) قبل استبداله ب FGF9. وفقا لبروتوكولهم ، فإن التعرض ل CHIR لمدة 4 أيام ، متبوعا ب FGF9 لمدة 3 أيام ، هو الطريقة الأكثر فعالية للحث على المراسلة الفورية من iPSCs. تم استخدام مرشحات Transwell كشكل للثقافة في إجراءاتهم. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة صعبة للمبتدئين. لذلك ، حاول Kumar et al.13 تغيير تنسيق الثقافة واختار تعليق الثقافة. قاموا بفصل الخلايا الملتصقة في اليوم 7 للبذر في صفائح منخفضة الالتصاق لمساعدتها على التجمع في أجسام جنينية (EBs) تحتوي على هياكل تشبه النيفرون. ومع ذلك ، كان تأثير الدفعة لهذه الطرق واضحا ، خاصة في iPSCs المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، ذكرت الأدبيات المختلفة أن تركيز CHIR يتراوح من 7 ميكرومتر إلى 12 ميكرومتر5،13،14.
لقد تكهننا بأن تركيز كثافة الخلايا و CHIR قد يؤثران على توليد المواد العضوية في iPSCs المختلفة ، وقد تم التحقق من ذلك عدة مرات في تجاربنا. وقد عدل البروتوكول الحالي قليلا طريقة دراسة كومار وآخرون.13 وزود المستخدمين بإجراء تدريجي. يظهر الجدول الزمني والتخطيطي للنهج في الشكل 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم وصف بروتوكول مفصل لتوليد عضويات الكلى من iPSCs ، بما في ذلك تعديلات طفيفة على الوسط القاعدي ، وكثافة الخلية الأولية ، وتركيز CHIR99021. في تجارب مختلفة ، تم العثور على العوامل الحاسمة لتوليد عضوي ناجح في الكلى لتكون التمايز الأولي للأديم المتوسط المتوسط (IM) وحالة الخلية في اليوم 7. علاوة على ذلك…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون للغاية لجميع أعضاء مختبر ماو وهيو ، في الماضي والحاضر ، للمناقشات الشيقة والمساهمات العظيمة في المشروع. نشكر المركز الوطني للبحوث السريرية لصحة الطفل على الدعم الكبير. تم دعم هذه الدراسة ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (U20A20351 إلى جيانهوا ماو ، 82200784 إلى ليدان هو) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ الصينية (No. LQ22C070004 إلى Lidan Hu) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة جيانغسو (المنح رقم. BK20210150 إلى جانج وانغ).
Materials
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #o7920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease – a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765 (2016).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
- SaxOn, L., Sariola, H. Early organogenesis of the kidney. Pediatric Nephrology. 1, 385-392 (1987).
- Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
- Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
- Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361 (2019).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
