Génération d’organoïdes rénaux en suspension à partir de cellules souches pluripotentes induites
Summary
Ce protocole présente une méthode complète et efficace pour produire des organoïdes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) en utilisant des conditions de culture en suspension. L’objectif principal de cette étude réside dans la détermination de la densité cellulaire initiale et de la concentration d’agonistes WNT, ce qui profite aux chercheurs intéressés par la recherche sur les organoïdes rénaux.
Abstract
Les organoïdes rénaux peuvent être générés à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) par diverses approches. Ces organoïdes sont très prometteurs pour la modélisation des maladies, le dépistage des médicaments et les applications thérapeutiques potentielles. Cet article présente une procédure étape par étape pour créer des organoïdes rénaux à partir de cellules iPS, en commençant par la strie primitive postérieure (PS) jusqu’au mésoderme intermédiaire (IM). L’approche s’appuie sur le milieu APEL 2, qui est un milieu défini, sans composant animal. Il est complété par une forte concentration d’agoniste WNT (CHIR99021) pendant une durée de 4 jours, suivie d’un facteur de croissance des fibroblastes 9 (FGF9)/héparine et d’une faible concentration de CHIR99021 pendant 3 jours supplémentaires. Au cours de ce processus, l’accent est mis sur la sélection de la densité cellulaire et de la concentration de CHIR99021 optimales au début des CSPi, car ces facteurs sont essentiels à la réussite de la génération d’organoïdes rénaux. Un aspect important de ce protocole est la culture en suspension dans une plaque peu adhérente, permettant à l’IM de se développer progressivement en structures néphroniques, englobant des structures tubulaires glomérulaires, tubulaires proximales et distales, le tout présenté dans un format visuellement compréhensible. Dans l’ensemble, ce protocole détaillé offre une technique efficace et spécifique pour produire des organoïdes rénaux à partir de diverses cellules iPS, garantissant des résultats réussis et cohérents.
Introduction
Le rein joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie physiologique, en fonction de son unité fonctionnelle. Les néphrons, qui excrètent les déchets, peuvent réguler la composition des fluides corporels. L’insuffisance rénale chronique (IRC), causée par des mutations héréditaires ou d’autres facteurs de risque élevés, évoluera éventuellement vers une insuffisance rénale terminale (ESKD)1,2. L’ESKD est apparemment due à la capacité de régénération limitée des néphrons. Ainsi, un traitement de remplacement rénal est nécessaire. La différenciation dirigée des cellules iPS humaines permet la génération in vitro d’organoïdes rénaux 3D spécifiques au patient, qui peuvent être utilisés pour étudier le développement des reins, modéliser des maladies spécifiques au patient et effectuer un criblage de médicaments néphrotoxiques 3,4.
Au cours du développement embryonnaire, les reins proviennent du mésoderme intermédiaire (IM), qui se différencie de la strie primitive (PS). La voie de signalisation WNT classique peut induire une différenciation supplémentaire de l’IM avec la participation coordonnée de FGF (FGF9, FGF20) et BMP (signalisation Bmp7 via JNK)5,6,7. Ils produisent deux populations cellulaires importantes de cellules progénitrices néphriques (NPC) : le bourgeon urétéral (UB) et le mésenchyme métanéphrique (MM), formant respectivement les canaux collecteurs et le néphron. Chaque néphron est constitué de segments glomérulaires et tubulaires, tels que les tubules proximaux et distals, et l’anse de Henle10,11. Selon la théorie mentionnée ci-dessus, les protocoles actuellement publiés imitent les cascades de signaux et la stimulation du facteur de croissance pour induire des organoïdes rénaux 5,12.
Au cours des dernières années, de nombreux protocoles ont été mis au point pour différencier les cellules iPS humaines en organoïdes rénaux 5,6,7,12. Takasato et al.7 ont optimisé la durée du traitement par CHIR (agoniste WNT) avant son remplacement par FGF9. Selon leur protocole, l’exposition au CHIR pendant 4 jours, suivie du FGF9 pendant 3 jours, est le moyen le plus efficace d’induire la MI à partir des cellules iPS. Les filtres Transwell ont été utilisés comme format de culture dans leur procédure ; Cependant, cette méthode est difficile pour les débutants. Par conséquent, Kumar et al.13 ont essayé de changer le format de la culture et ont choisi de suspendre la culture. Ils ont dissocié les cellules adhérentes au jour 7 pour les ensemencer dans des plaques peu adhérentes afin de les aider à s’assembler en corps embryoïdes (EB) contenant des structures ressemblant à des néphrons. Cependant, l’effet batch de ces méthodes était évident, en particulier dans différentes cellules iPS. De plus, différentes publications ont rapporté que la concentration de CHIR variait de 7 μM à 12 μM 5,13,14.
Nous avons émis l’hypothèse que la concentration de la densité cellulaire et du CHIR pourrait affecter la génération d’organoïdes dans différentes cellules iPS, ce qui a été vérifié à de nombreuses reprises dans nos expériences. Le présent protocole a légèrement modifié la méthode d’étude de Kumar et al.13 et a fourni aux utilisateurs une procédure étape par étape. L’échéancier et le schéma de l’approche sont présentés à la figure 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un protocole détaillé a été décrit pour générer des organoïdes rénaux à partir de CSPi, impliquant des modifications mineures du milieu basal, de la densité cellulaire initiale et de la concentration de CHIR99021. Dans diverses expériences, les facteurs critiques pour une génération réussie d’organoïdes rénaux se sont avérés être la différenciation initiale du mésoderme intermédiaire (IM) et l’état cellulaire au jour 7. De plus, différentes lignées de CSPi présentaient des variations dans l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes extrêmement reconnaissants à tous les membres du Mao et du Hu Lab, passés et présents, pour les discussions intéressantes et les grandes contributions au projet. Nous remercions le Centre national de recherche clinique pour la santé de l’enfant pour son grand soutien. Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (U20A20351 à Jianhua Mao, 82200784 à Lidan Hu), la Fondation des sciences naturelles de la province chinoise du Zhejiang (No. LQ22C070004 à Lidan Hu) et la Fondation des sciences naturelles de la province du Jiangsu (subventions n° BK20210150 à Gang Wang).
Materials
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #o7920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
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