人工多能性幹細胞からの懸濁液中の腎臓オルガノイドの生成
Summary
このプロトコルは懸濁液培養条件を使用して誘導された多能性幹細胞(iPS細胞)から腎臓オルガノイドを生産するための包括的で効率的な方法を提示します。この研究の主な重点は、初期細胞密度とWNTアゴニスト濃度の決定にあり、それによって腎臓オルガノイド研究に関心のある研究者に利益をもたらします。
Abstract
腎臓オルガノイドは、人工多能性幹細胞(iPS細胞)からさまざまなアプローチで作製することができます。これらのオルガノイドは、疾患モデリング、薬物スクリーニング、および潜在的な治療用途に大きな期待が寄せられています。本稿では、iPS細胞から腎臓オルガノイドを作製する手順を、後原始線条(PS)から中間中胚葉(IM)まで順を追って説明します。このアプローチは、動物成分を含まない定義された培地であるAPEL 2培地に依存しています。高濃度のWNTアゴニスト(CHIR99021)を4日間補給し、続いて線維芽細胞成長因子9(FGF9)/ヘパリンと低濃度のCHIR99021をさらに3日間補給します。このプロセスでは、iPS細胞の開始時に最適な細胞密度とCHIR99021濃度を選択することに重点が置かれます。このプロトコルの重要な面は、IMが徐々にネフロン構造に発展し、糸球体、近位管状、および遠位管状構造を網羅し、すべて視覚的に理解可能な形式で提示されるようにする、低接着プレートでの懸濁培養です。全体として、この詳細なプロトコールは、多様なiPS細胞から腎臓オルガノイドを作製するための効率的で特異的な技術を提供し、成功し、一貫した結果を保証します。
Introduction
腎臓は、その機能単位に応じて、生理学的恒常性を維持する上で重要な役割を果たします。老廃物を排泄するネフロンは、体液の組成を調節することができます。遺伝性突然変異などの高リスク因子によって引き起こされる慢性腎臓病(CKD)は、最終的には末期腎臓病(ESKD)に進行します1,2。ESKDは、ネフロンの再生能力が限られていることが原因と思われます。したがって、腎代替療法が必要です。ヒトiPS細胞の分化を指示することで、患者特異的な3D腎臓オルガノイドをin vitroで作製することができ、腎臓の発生の研究、患者固有の疾患のモデル化、腎毒性薬物スクリーニングの実施に使用できます3,4。
胚発生中、腎臓は中間中胚葉(IM)に由来し、原始線条(PS)と区別されます。古典的なWNTシグナル伝達経路は、FGF(FGF9、FGF20)とBMP(JNKを介したBmp7シグナル伝達)の協調的な関与により、IMのさらなる分化を誘導する可能性があります5,6,7。それらは、腎前駆細胞(NPC)の2つの重要な細胞集団、すなわち尿管芽(UB)と中腎間充織(MM)を産生し、それぞれ集合管とネフロンを形成する8,9。各ネフロンは、近位尿細管や遠位尿細管などの糸球体と管状のセグメント、およびヘンレのループで構成されています10,11。上記の理論によると、現在公開されているプロトコルは、シグナルカスケードと成長因子刺激を模倣して腎臓オルガノイドを誘導します5,12。
過去数年間で、ヒトiPS細胞を腎臓オルガノイドに分化するための多くのプロトコルが開発されてきました5,6,7,12。Takasato et al.7は、FGF9で置き換える前に、CHIR(WNTアゴニスト)治療の期間を最適化しました。彼らのプロトコルによると、CHIRを4日間曝露し、その後FGF9を3日間曝露することが、iPS細胞からのIMを誘導する最も効果的な方法です。トランズウェルフィルターは、その手順の培養フォーマットとして利用されました。ただし、この方法は初心者には難しいです。そのため、Kumar et al.13は培養形式を変えようとし、培養を中断することを選択しました。7日目に接着細胞を解離し、ネフロン様構造を含む胚様体(EB)に集合するのを助けるために、接着性の低いプレートに播種した。しかし、これらの方法のバッチ効果は、特に異なるiPS細胞で明らかでした。さらに、さまざまな文献で、CHIRの濃度が7μMから12μMまで変化したことが報告されています5,13,14。
細胞密度とCHIRの濃度が、異なるiPS細胞におけるオルガノイドの生成に影響を与えるのではないかと推測し、実験で何度も検証してきました。本プロトコルは、Kumarらの研究方法をわずかに変更し13 、ユーザーに段階的な手順を提供しました。このアプローチのスケジュールと概略図を 図1に示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
iPS細胞から腎臓オルガノイドを作製するための詳細なプロトコルが記載されており、基礎培地、初期細胞密度、およびCHIR99021濃度にわずかな変更を加えます。さまざまな実験において、腎臓オルガノイドの作製を成功させるための重要な要素は、中間中胚葉(IM)の初期分化と7日目の細胞状態であることがわかりました。さらに、iPS細胞株が異なれば、細胞増殖能や分化能にもばらつきがあり?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
過去と現在のMaoとHu Labのメンバーの皆さんには、興味深い議論とプロジェクトへの多大な貢献をしていただき、心から感謝しています。国立成育医療研究センターの多大なるご支援に感謝いたします。本研究は、中国国家自然科学基金会(U20A20351は毛建華、胡立丹82200784)、中国浙江省自然科学基金会(No.LQ22C070004 to Lidan Hu)、江蘇省自然科学基金会(助成金番号。BK20210150 Gang Wang)に。
Materials
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #o7920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
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