İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin korunması ve ayırt edilmesi için otomatik bir kültür sistemi
Summary
Burada, otomatik bir hücre kültürü sistemi için bir protokol sunuyoruz. Bu otomatik kültür sistemi, işçiliği azaltır ve indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerin bakımından, çeşitli hücre tiplerine farklılaşmaya kadar, indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerin işlenmesine aşina olmayan araştırmacılar da dahil olmak üzere kullanıcılara fayda sağlar.
Abstract
Sonsuz kendi kendine çoğalma yeteneğine sahip insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC’ler), nadir hastalık patolojilerinin aydınlatılması, yeni ilaçların geliştirilmesi ve hasarlı organları restore etmeyi amaçlayan rejeneratif tıp dahil olmak üzere çok sayıda alanda uygulamaları olması beklenmektedir. Buna rağmen, hiPSC’lerin sosyal uygulaması hala sınırlıdır. Bu kısmen, iPSC’lerin küçük çevresel değişikliklere karşı yüksek duyarlılığı nedeniyle, ileri bilgi ve sofistike teknik becerilerle bile kültürdeki farklılaşmayı yeniden üretmenin zorluğundan kaynaklanmaktadır. Otomatik bir kültür sisteminin uygulanması bu sorunu çözebilir. Bir araştırmacının becerisinden bağımsız olarak yüksek tekrarlanabilirliğe sahip deneyler, çeşitli enstitüler arasında paylaşılan bir prosedüre göre beklenebilir. Daha önce iPSC kültürlerini koruyabilen ve farklılaşmayı indükleyebilen birkaç otomatik kültür sistemi geliştirilmiş olsa da, bu sistemler insanlaştırılmış, çok eklemli robotik kollardan yararlandıkları için ağır, büyük ve maliyetlidir. Yukarıdaki sorunları iyileştirmek için, daha kompakt, daha hafif ve daha ucuz olmasını sağlayan basit bir x-y-z ekseni kayar ray sistemi kullanarak yeni bir sistem geliştirdik. Ayrıca, kullanıcı yeni taşıma görevleri geliştirmek için yeni sistemdeki parametreleri kolayca değiştirebilir. Bir görev oluşturulduktan sonra, kullanıcının tek yapması gereken iPSC’yi hazırlamak, istenen görev için gereken reaktifleri ve sarf malzemelerini önceden sağlamak, görev numarasını seçmek ve zamanı belirtmektir. Sistemin, besleyici hücreler olmadan birkaç geçiş yoluyla iPSC’leri farklılaşmamış bir durumda tutabildiğini ve kardiyomiyositler, hepatositler, nöral progenitörler ve keratinositler dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine farklılaşabildiğini doğruladık. Sistem, yetenekli araştırmacılara ihtiyaç duymadan kurumlar arasında yüksek oranda tekrarlanabilir deneylere olanak tanıyacak ve yeni girişlerin önündeki engelleri azaltarak hiPSC’lerin daha geniş bir araştırma alanı yelpazesinde sosyal olarak uygulanmasını kolaylaştıracaktır.
Introduction
Bu makale, bir firma ile işbirliği yaparak ürettiğimiz insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC) için otomatik bir kültür sistemi için gerçek ve ayrıntılı kullanım prosedürleri sağlamayı ve temsili sonuçları göstermeyi amaçlamaktadır.
Makalenin 2007 yılında yayınlanmasından bu yana, iPSC tüm dünyada dikkat çekmektedir1. En büyük özelliği herhangi bir somatik hücreye farklılaşabilmesi nedeniyle, rejeneratif tıp, inatçı hastalıkların nedenlerinin aydınlatılması ve yeni terapötik ilaçların geliştirilmesi gibi çeşitli alanlarda uygulanması beklenmektedir 2,3. Ek olarak, insan iPSC’den türetilen somatik hücrelerin kullanılması, önemli etik kısıtlamalara tabi olan hayvan deneylerini azaltabilir. iPSC’lerle yeni yöntemler araştırmak için sürekli olarak çok sayıda homojen iPSC’ye ihtiyaç duyulsa da, bunları yönetmek çok zahmetlidir. Ayrıca, iPSC’yi ele almak, ince kültürel ve çevresel değişikliklere karşı bile yüksek hassasiyeti nedeniyle zordur.
Bu sorunu çözmek için, insanlar yerine otomatik kültür sistemlerinin görevleri yerine getirmesi beklenir. Bazı gruplar, hücre bakımı ve farklılaşması için birkaç otomatik insan pluripotent kök hücre kültürü sistemi geliştirmiş ve başarılarını yayınlamıştır 4,5,6. Bu sistemler, çok eklemli robotik kol(lar)ı donatır. Robotik kollar, sadece insan kol hareketlerini yüksek oranda taklit etmeleri bakımından değil, aynı zamanda kol(lar) için daha yüksek maliyet(ler), daha büyük ve daha ağır sistem paketlemeleri ve hedeflenen hareketleri elde etmek için mühendisler tarafından zaman alıcı eğitim çabaları gerektirmeleri bakımından da kusurludur 7,8. Cihazın ekonomik, alan ve insan kaynakları tüketimi noktalarında daha fazla araştırma tesisine tanıtılmasını kolaylaştırmak için, iPSC’nin bakımı ve çeşitli hücre tiplerinefarklılaşması için yeni bir otomatik kültür sistemi geliştirdik 9.
Yeni sistem için gerekçemiz, çok eklemli robotik kollar yerine X-Y-Z eksenli bir ray sistemini benimsemekti9. Robotik kolların karmaşık el benzeri işlevlerini değiştirmek için, bu sisteme üç tür özel işlevsel kol ucunu otomatik olarak değiştirebilen yeni bir fikir uyguladık. Burada, süreç boyunca mühendislerin katkılarına ihtiyaç duyulmaması nedeniyle, kullanıcıların yazılım üzerinde basit siparişlerle nasıl kolayca görev programları yapabileceklerini de gösteriyoruz.
Robotik kültür sistemlerinden biri, farklılaşma için 3D hücre agregaları olarak 96 oyuklu plakalar kullanılarak embriyoid cisimlerin yapımını göstermiştir4. Burada bildirilen sistem 96 oyuklu plakaları işleyemez. Bunlardan biri, bir insan pluripotent kök hücresi olmamasına rağmen, bir hücre hattı kullanarak mevcut iyi üretim uygulaması (cGMP) derecesine ulaştı5. Burada ayrıntıları verilen otomatik kültür sistemi, laboratuvar deneylerine yardımcı olmak amacıyla geliştirilmiştir (Şekil 1). Bununla birlikte, seviye IV güvenlik kabinine eşdeğer temiz seviyeleri tutmak için yeterli sisteme sahiptir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokoldeki kritik bir adım, bir kullanıcı herhangi bir hata bulursa, herhangi bir zamanda iptal, durdur veya sıfırla düğmesine tıklaması ve ilk adımdan baştan başlamasıdır. Yazılım, çifte rezervasyon, sistem görevleri etkinken kapıların açılması ve ikmal eksikliği dahil olmak üzere insan hatalarından kaçınabilir. İstenilen somatik hücreye başarılı ve verimli bir şekilde farklılaşmak için bir diğer kritik nokta, pluripotent kök hücre hatlarının uygun seçimidir, çünkü her plu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japonya’daki Yeni İş Geliştirme Merkezi’nden alınan bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
References
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
- Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
- Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
- Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647 (2015).
- McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn’t anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
- Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41 (2017).
- Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).
- Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
- Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
- International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).
