Summary

نظام استزراع آلي للحفاظ على الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان وتمييزها

Published: January 26, 2024
doi:

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لنظام زراعة الخلايا الآلي. يقلل نظام الاستزراع الآلي هذا من العمالة ويفيد المستخدمين ، بما في ذلك الباحثين غير المعتادين على التعامل مع الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS) ، من صيانة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا.

Abstract

من المتوقع أن يكون للخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) ذات القدرة اللانهائية على التكاثر الذاتي تطبيقات في العديد من المجالات ، بما في ذلك توضيح أمراض الأمراض النادرة ، وتطوير أدوية جديدة ، والطب التجديدي الذي يهدف إلى استعادة الأعضاء التالفة. على الرغم من ذلك ، لا يزال التنفيذ الاجتماعي ل hiPSCs محدودا. ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة إعادة إنتاج التمايز في الثقافة ، حتى مع المعرفة المتقدمة والمهارات التقنية المتطورة ، بسبب الحساسية العالية ل iPSCs للتغيرات البيئية الدقيقة. يمكن أن يؤدي تطبيق نظام الثقافة الآلي إلى حل هذه المشكلة. يمكن توقع تجارب ذات قابلية استنساخ عالية مستقلة عن مهارة الباحث وفقا لإجراء مشترك عبر مختلف المعاهد. على الرغم من أن العديد من أنظمة الاستزراع الآلي التي يمكنها الحفاظ على ثقافات iPSC وتحفيز التمايز قد تم تطويرها سابقا ، إلا أن هذه الأنظمة ثقيلة وكبيرة ومكلفة لأنها تستخدم أذرعا روبوتية إنسانية متعددة المفاصل. لتحسين المشكلات المذكورة أعلاه ، قمنا بتطوير نظام جديد باستخدام نظام سكة منزلق بسيط للمحور x-y-z ، مما يسمح له بأن يكون أكثر إحكاما وأخف وزنا وأرخص. علاوة على ذلك ، يمكن للمستخدم بسهولة تعديل المعلمات في النظام الجديد لتطوير مهام معالجة جديدة. بمجرد إنشاء المهمة ، كل ما يحتاجه المستخدم هو إعداد iPSC ، وتوفير الكواشف والمواد الاستهلاكية اللازمة للمهمة المطلوبة مسبقا ، وتحديد رقم المهمة ، وتحديد الوقت. أكدنا أن النظام يمكنه الحفاظ على iPSCs في حالة غير متمايزة من خلال عدة ممرات بدون خلايا مغذية والتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك خلايا عضلة القلب وخلايا الكبد والأسلاف العصبية والخلايا الكيراتينية. سيمكن النظام من إجراء تجارب قابلة للتكرار بدرجة كبيرة عبر المؤسسات دون الحاجة إلى باحثين مهرة وسيسهل التنفيذ الاجتماعي ل hiPSCs في مجموعة واسعة من مجالات البحث من خلال تقليل العقبات التي تحول دون الدخول الجديد.

Introduction

تهدف هذه المقالة إلى توفير إجراءات معالجة فعلية ومفصلة لنظام زراعة آلي للخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSC) ، والتي أنتجناها بالتعاون مع شركة ، وإظهار نتائج تمثيلية.

منذ نشر المقال في عام 2007 ، جذبت iPSC الانتباه في جميع أنحاء العالم1. نظرا لأعظم ميزة لها تتمثل في القدرة على التمايز إلى أي نوع من الخلايا الجسدية ، فمن المتوقع أن يتم تطبيقها في مجالات مختلفة مثل الطب التجديدي ، وتوضيح أسباب الأمراض المستعصية ، وتطوير أدوية علاجية جديدة 2,3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام الخلايا الجسدية البشرية المشتقة من iPSC يمكن أن يقلل من التجارب على ، والتي تخضع لقيود أخلاقية كبيرة. على الرغم من أن العديد من iPSCs المتجانسة مطلوبة باستمرار للبحث عن طرق جديدة مع iPSCs ، إلا أن إدارتها شاقة للغاية. علاوة على ذلك ، فإن التعامل مع iPSC أمر صعب بسبب حساسيته العالية ، حتى للتغيرات الثقافية والبيئية الدقيقة.

لحل هذه المشكلة ، من المتوقع أن تؤدي أنظمة الثقافة الآلية المهام بدلا من البشر. طورت بعض المجموعات عددا قليلا من أنظمة زراعة الخلايا الجذعية البشرية الآلية متعددة القدرات لصيانة الخلايا والتمايز ونشرت إنجازاتها4،5،6. تجهز هذه الأنظمة ذراعا (أذرع) روبوتية متعددة المفاصل. لا تتمتع الأذرع الروبوتية بميزة من حيث أنها تحاكي حركات الذراع البشرية فحسب ، بل إنها أيضا تعيب من حيث أنها تتطلب تكلفة (تكاليف) أعلى للذراع (الذراعات) ، وتغليف نظام أكبر وأثقل ، وجهود تعليمية تستغرق وقتا طويلا من قبل المهندسين للحصول على الحركات المستهدفة 7,8. من أجل تسهيل إدخال الجهاز إلى المزيد من المرافق البحثية في نقاط الاستهلاك الاقتصادي والمساحي والموارد البشرية ، قمنا بتطوير نظام ثقافة آلي جديد لصيانة وتمييز iPSC إلى أنواع مختلفة من الخلايا9.

كان الأساس المنطقي للنظام الجديد هو اعتماد نظام سكة حديد المحور X-Y-Z بدلا من الأذرع الروبوتية متعددة المفاصل9. لاستبدال الوظائف المعقدة الشبيهة باليد للأذرع الروبوتية ، قمنا بتطبيق فكرة جديدة على هذا النظام ، والتي يمكنها تلقائيا تغيير ثلاثة أنواع من أطراف الذراع الوظيفية المحددة. هنا ، نشير أيضا إلى كيف يمكن للمستخدمين بسهولة عمل جداول المهام بأوامر بسيطة على البرامج بسبب عدم وجود متطلبات لمساهمات المهندسين طوال العملية.

أظهر أحد أنظمة الاستزراع الروبوتي صنع أجسام جنينية باستخدام 96 لوحة بئر كمجاميع خلايا ثلاثية الأبعاد للتمايز4. لا يمكن للنظام المذكور هنا التعامل مع 96 لوحة بئر. حقق أحدهما درجة ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (cGMP) باستخدام خط الخلية ، على الرغم من أنها لم تكن خلية جذعية بشرية متعددة القدرات5. تم الآن تطوير نظام الاستزراع الآلي المفصل هنا بهدف محدد هو مساعدة التجارب المعملية (الشكل 1). ومع ذلك ، فإنه يحتوي على أنظمة كافية للحفاظ على مستويات نظيفة تعادل خزانة أمان من المستوى الرابع.

Protocol

وافقت لجنة الأخلاقيات بجامعة كانساي الطبية على توليد واستخدام iPSCs الصحية المشتقة من المتطوعين المسماة KMUR001 (الموافقة رقم 2020197). قدم المتبرع ، الذي تم تجنيده علنا ، موافقة رسمية مستنيرة ووافق على الاستخدام العلمي للخلايا. ملاحظة: الواجهة الحالية (البرنامج الخاص المسمى “ccssHMI” ا…

Representative Results

صيانة الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنساناستخدمنا ثلاثة خطوط hPSC (RIKEN-2F و 253G1 و KMUR001). لقد قمنا بتحسين بروتوكول الصيانة من خلال التجارب اليومية التي يتم إجراؤها يدويا وقمنا بتحسين البرامج التفصيلية من خلال التجارب الأولية السبع التي يقوم بها النظام. على سبيل المثا?…

Discussion

تتمثل إحدى الخطوات المهمة في البروتوكول في أنه إذا وجد المستخدم أي أخطاء ، فانقر فوق الزر “إلغاء” أو “إيقاف” أو “إعادة تعيين” في أي وقت وابدأ من جديد من الخطوة الأولى. يمكن للبرنامج تجنب الأخطاء البشرية ، بما في ذلك الحجز المزدوج ، وفتح الأبواب أثناء تنشيط مهام النظام ، ونقص التجديد. نقطة أخرى…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة بمنحة من مركز ترويج الأعمال الجديدة ، شركة باناسونيك لهندسة الإنتاج المحدودة ، أوساكا ، اليابان.

Materials

0.15% bovine serum albumin fraction V Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan 9048-46-8
1% GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
10 cm plastic plates  Corning Inc., NY, United States 430167
253G1 RKEN Bioresource Research Center HPS0002
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
Actinin  mouse Abcam ab9465
Activin A  Nacali Tesque 18585-81
Adenine Thermo Fisher Scientific A14906.30
Albumin  rabbit Dako A0001
All-trans retinoic acid Fuji Film Wako Chemical Inc.  186-01114
Automated culture system Panasonic
B-27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
bFGF Fuji Film Wako Chemical Inc.  062-06661
BMP4  Thermo Fisher Scientific PHC9531
Bovine serum albumin Merck 810037
CHIR-99021  MCE, NJ, United States #HY-10182 252917-06-9
Defined Keratinocyte-SFM Thermo Fisher Scientific 10744019 Human keratinocyte medium
Dexamethasone Merck 266785
Dihexa  TRC, Ontario, Canada 13071-60-8 rac-1,2-Dihexadecylglycerol
Disposable hemocytometer CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific C10228
Dorsomorphin Thermo Fisher Scientific 1219168-18-9
Dulbecco’s modified Eagle medium/F12  Fuji Film Wako Chemical Inc. 12634010
EGF Fuji Film Wako Chemical Inc.  053-07751
Essential 8  Thermo Fisher Scientific A1517001 Human pluripotent stem cell medium
Fetal bovine serum  Biowest, FL, United States S140T
FGF-basic  Nacalai Tesque Inc. 19155-07
Forskolin Thermo Fisher Scientific J63292.MF
Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081 Glutamine supplement
Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 Thermo Scientific A11056
HNF-4A  goat Santacruz 6556
Hydrocortisone Thermo Fisher Scientific A16292.06
Hydrocortisone 21-hemisuccinate Merck H2882
iMatrix511 Silk  Nippi Inc., Tokyo, Japan 892 021 Cell culture matrix
Insulin-transferrin-selenium Thermo Fisher Scientific 41400045
Keratin 1  mouse Santacruz 376224
Keratin 10  rabbit BioLegend 19054
KMUR001 Kansai Medical University  Patient-derived iPSCs 
Knockout serum replacement Thermo Fisher Scientific 10828010
L-ascorbic acid 2-phosphate  A8960, Merck A8960
Leibovitz’s L-15 medium  Fuji Film Wako Chemical Inc. 128-06075
Matrigel Corning Inc. 354277
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 Thermo Scientific A21202
N-2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502048
Nestin mouse Santacruz 23927
Neurobasal medium Thermo Fisher Scientific 21103049
Neurofilament  rabbit Chemicon AB1987
Neutristem Sartrius AG, Göttingen, Germany 05-100-1A cell culture medium 
Oct 3/4  mouse BD 611202
PBS(-) Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan 14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 Thermo Scientific A21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 Thermo Scientific A10040
Recombinant human albumin  A0237, Merck, Darmstadt, Germany A9731
Rho kinase inhibitor, Y-27632  Sellec Inc., Tokyo, Japan 129830-38-2
RIKEN 2F RKEN Bioresource Research Center HPS0014 undifferentiated hiPSCs 
RPMI 1640  Thermo Fisher Scientific #11875 12633020
SB431542 Thermo Fisher Scientific 301836-41-9
Sodium L-ascorbate Merck A4034-100G
SSEA-4  mouse Millipore MAB4304
StemFit AK02N  Ajinomoto, Tokyo, Japan AK02 cell culture medium 
TnT rabbit Abcam ab92546
TRA 1-81 mouse Millipore MAB4381
Triiodothyronine Thermo Fisher Scientific H34068.06
TripLETM express enzyme  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States 12604013
Trypan blue solution  Nacalai Tesque, Kyoto, Japan 20577-34
Tryptose phosphate broth Merck T8782-500G
Wnt-C59  Bio-techne, NB, United Kingdom 5148
β Equation 1 Tublin  mouse Promega G712A

References

  1. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  2. Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
  3. Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
  4. Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
  5. Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
  6. Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647 (2015).
  7. McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn’t anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
  8. Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41 (2017).
  9. Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).
  10. Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  11. Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
  12. Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
  13. Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
  14. International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
  15. Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).

Play Video

Cite This Article
Bando, K., Yamashita, H., Hattori, F. An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (203), e65672, doi:10.3791/65672 (2024).

View Video