מערכת תרבית אוטומטית לשמירה והתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול למערכת תרבית תאים אוטומטית. מערכת תרבית אוטומטית זו מפחיתה את העבודה ומועילה למשתמשים, כולל חוקרים שאינם בקיאים בטיפול בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS), החל מתחזוקה של תאי iPS ועד התמיינות לסוגים שונים של תאים.
Abstract
תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) עם יכולת אינסופית של התרבות עצמית צפויים להיות בעלי יישומים בתחומים רבים, כולל הבהרה של פתולוגיות של מחלות נדירות, פיתוח תרופות חדשות ורפואה רגנרטיבית שמטרתה לשקם איברים פגועים. למרות זאת, היישום החברתי של hiPSCs עדיין מוגבל. זאת, בין היתר, בשל הקושי לשחזר את הבידול בתרבות, אפילו עם ידע מתקדם וכישורים טכניים מתוחכמים, בשל הרגישות הגבוהה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לשינויים סביבתיים זעירים. היישום של מערכת תרבות אוטומטית יכול לפתור בעיה זו. ניתן לצפות לניסויים בעלי יכולת שחזור גבוהה שאינה תלויה במיומנותו של החוקר על פי נוהל משותף בין מכונים שונים. למרות שמספר מערכות תרבות אוטומטיות המסוגלות לשמור על תרביות iPSC ולגרום לבידול פותחו בעבר, מערכות אלה הן כבדות, גדולות ויקרות מכיוון שהן עושות שימוש בזרועות רובוטיות אנושיות ורב-מפרקיות. כדי לשפר את הבעיות הנ”ל, פיתחנו מערכת חדשה באמצעות מערכת פשוטה של מסילות הזזה על ציר x-y-z, המאפשרת לה להיות קומפקטית יותר, קלה יותר וזולה יותר. יתר על כן, המשתמש יכול בקלות לשנות פרמטרים במערכת החדשה כדי לפתח משימות טיפול חדשות. לאחר קביעת משימה, כל שעל המשתמש לעשות הוא להכין את ה- iPSC, לספק מראש את הריאגנטים והחומרים המתכלים הדרושים למשימה הרצויה, לבחור את מספר המשימה ולציין את השעה. אישרנו כי המערכת יכולה לשמור על תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במצב בלתי ממוין באמצעות מספר מעברים ללא תאי הזנה ולהתמיין לסוגי תאים שונים, כולל קרדיומיוציטים, הפטוציטים, אבות עצביים וקרטינוציטים. המערכת תאפשר ניסויים בעלי יכולת שחזור גבוהה בין מוסדות ללא צורך בחוקרים מיומנים ותקל על יישום חברתי של hiPSCs במגוון רחב יותר של תחומי מחקר על ידי הפחתת המכשולים לערכים חדשים.
Introduction
מאמר זה נועד לספק נהלי טיפול בפועל ומפורטים עבור מערכת תרבית אוטומטית עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC), אשר ייצרנו על ידי שיתוף פעולה עם חברה, ולהציג תוצאות מייצגות.
מאז פרסום המאמר בשנת 2007, iPSC מושך תשומת לב בכל רחבי העולם1. בשל התכונה הגדולה ביותר של היכולת להתמיין לכל סוג של תא סומטי, הוא צפוי להיות מיושם בתחומים שונים כגון רפואה רגנרטיבית, להבהיר את הגורמים למחלות עקשניות, ופיתוח תרופות טיפוליות חדשות 2,3. בנוסף, שימוש בתאים סומטיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים בבני אדם עשוי להפחית ניסויים בבעלי חיים, הכפופים למגבלות אתיות משמעותיות. למרות שתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הומוגניים רבים נדרשים כל הזמן לחקור שיטות חדשות עם iPSCs, זה מייגע מדי לנהל אותם. יתר על כן, הטיפול ב- iPSC קשה בגלל רגישותו הגבוהה, אפילו לשינויים תרבותיים וסביבתיים עדינים.
כדי לפתור בעיה זו, מערכות תרבות אוטומטיות צפויות לבצע משימות במקום בני אדם. קבוצות מסוימות פיתחו כמה מערכות אוטומטיות לתרבית תאי גזע פלוריפוטנטיות אנושיות לתחזוקה והתמיינות של תאים ופרסמו את הישגיהן 4,5,6. מערכות אלה מציידות זרועות רובוטיות רב-מפרקיות. לזרועות רובוטיות יש לא רק ערך בכך שהן מחקות מאוד תנועות זרוע אנושיות, אלא גם ראויות בכך שהן דורשות עלויות גבוהות יותר עבור הזרוע(ות), אריזות מערכת גדולות וכבדות יותר, ומאמצי חינוך גוזלי זמן על ידי המהנדסים כדי להשיג את התנועות המכוונות 7,8. על מנת להקל על החדרת המנגנון למתקני מחקר נוספים בנקודות של צריכת משאבים כלכליים, חלל ומשאבי אנוש, פיתחנו מערכת תרבית אוטומטית חדשנית לתחזוקה והתמיינות של iPSC לסוגי תאים שונים9.
הרציונל שלנו למערכת החדשה היה לאמץ מערכת מסילות ציר X-Y-Z במקום זרועות רובוטיות רב-מפרקיות9. כדי להחליף את הפונקציות המורכבות דמויות היד של זרועות רובוטיות, יישמנו רעיון חדש למערכת זו, אשר יכול לשנות באופן אוטומטי שלושה סוגים של קצוות זרוע פונקציונליים ספציפיים. כאן, אנו גם מציינים כיצד משתמשים יכולים בקלות לבצע לוחות זמנים של משימות עם הזמנות פשוטות בתוכנה בגלל היעדר דרישות לתרומות המהנדסים לאורך כל התהליך.
אחת ממערכות התרבית הרובוטיות הדגימה יצירת גופים עובריים באמצעות לוחות 96 בארות כצברי תאים תלת-ממדיים להתמיינות4. המערכת המדווחת כאן אינה יכולה להתמודד עם לוחות 96 בארות. אחד מהם השיג את הציון הנוכחי של תנאי ייצור נאותים (cGMP) באמצעות קו תאים, למרות שזה לא היה תא גזע פלוריפוטנטי אנושי5. מערכת התרביות האוטומטיות המפורטת כאן פותחה כעת במטרה ספציפית לסייע בניסויי מעבדה (איור 1). עם זאת, יש לו מספיק מערכות כדי לשמור על רמות נקיות שוות ערך לארון בטיחות ברמה IV.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלב קריטי בפרוטוקול הוא שאם משתמש מוצא תקלות כלשהן, לחץ על לחצן ביטול, עצירה או איפוס בכל עת והתחל מחדש מהצעד הראשון. התוכנה יכולה למנוע טעויות אנוש, כולל הזמנה כפולה, פתיחת דלתות בזמן שמשימות המערכת פעילות, וחוסר חידוש. נקודה קריטית נוספת להתמיינות מוצלחת ויעילה לתא הסומטי הרצוי היא בחירה …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענק מהמרכז לקידום עסקים חדשים, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., אוסקה, יפן.
Materials
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
References
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
- Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
- Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
- Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647 (2015).
- McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn’t anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
- Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41 (2017).
- Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).
- Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
- Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
- International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).
