אפיון In vivo של השפעות כימיות משבשות אנדוקריניות באמצעות עכבר מחוון פעולה של הורמון בלוטת התריס
Summary
מודל העכבר Thyroid Hormone Action Indicator פותח כדי לאפשר כימות ספציפי לרקמה של פעולת הורמון בלוטת התריס המקומית באמצעות מנגנון הבקרה האנדוגני שלו. לאחרונה הוכח כי המודל מתאים לאפיון כימיקלים משבשי אנדוקרינית המקיימים אינטראקציה עם כלכלת הורמוני בלוטת התריס, הן במתודולוגיות ex vivo והן במתודולוגיות in vivo .
Abstract
הורמוני בלוטת התריס (TH) ממלאים תפקיד קריטי בחילוף החומרים בתאים ובתפקוד הרקמות. כלכלת TH רגישה לכימיקלים משבשים אנדוקריניים (EDC) שיכולים להפריע לייצור הורמונים או לפעולה. מזהמים סביבתיים רבים הם EDC, המייצגים איום מתפתח הן על בריאות האדם והן על הייצור החקלאי. זה הוביל לדרישה מוגברת למערכות בדיקה מתאימות כדי לבחון את ההשפעות של EDCs פוטנציאליים. עם זאת, המתודולוגיות הנוכחיות עומדות בפני אתגרים. רוב מערכות הבדיקה משתמשות בסמנים אנדוגניים המווסתים על ידי תהליכים רגולטוריים מרובים, לעתים קרובות מורכבים, מה שמקשה על הבחנה בין השפעות ישירות ועקיפות. יתר על כן, מערכות בדיקה במבחנה חסרות את המורכבות הפיזיולוגית של מטבוליזם EDC ופרמקוקינטיקה ביונקים. בנוסף, חשיפה ל-EDCs סביבתיים כרוכה בדרך כלל בתערובת של תרכובות מרובות, כולל מטבוליטים הנוצרים in vivo , כך שלא ניתן להתעלם מהאפשרות של אינטראקציות. מורכבות זו מקשה על אפיון EDC. עכבר מחוון הפעולה של הורמון בלוטת התריס (THAI) הוא מודל מהונדס הנושא מערכת מדווחת לוציפראז המגיבה TH, המאפשרת הערכה של פעולת TH ספציפית לרקמות. ניתן להעריך את ההשפעות הספציפיות לרקמות של כימיקלים על פעולת TH מקומית על ידי כימות ביטוי כתב לוציפראז בדגימות רקמה. יתר על כן, עם הדמיה in vivo , מודל העכבר התאילנדי מאפשר מחקרי אורך על ההשפעות של EDCs פוטנציאליים בבעלי חיים חיים. גישה זו מספקת כלי רב עוצמה לבדיקת חשיפה ארוכת טווח, מבני טיפול מורכבים או גמילה, שכן היא מאפשרת להעריך שינויים בפעולת TH מקומית לאורך זמן באותה חיה. דוח זה מתאר את התהליך של מדידות הדמיה in vivo על עכברים תאילנדים. הפרוטוקול הנדון כאן מתמקד בפיתוח והדמיה של עכברי יתר ותת-פעילות של בלוטת התריס, שיכולים לשמש כאמצעי בקרה. חוקרים יכולים להתאים או להרחיב את הטיפולים המוצגים כדי לענות על הצרכים הספציפיים שלהם, ולהציע גישה בסיסית לחקירה נוספת.
Introduction
איתות הורמון בלוטת התריס (TH) הוא מווסת בסיסי של חילוף החומרים בתאים, חיוני להתפתחות תקינה ולתפקוד רקמות אופטימלי בבגרות1. בתוך רקמות, פעולת TH נשלטת היטב על ידי מנגנון מולקולרי מורכב, המאפשר תחזוקה ספציפית לרקמות של רמות TH מקומיות. אוטונומיה זו של רקמות שונות מרמות TH במחזור היא בעלת חשיבות רבה 2,3,4.
לכימיקלים רבים יש פוטנציאל לשבש את התפקודים האנדוקריניים והם נמצאים בסביבה כמזהמים. קיים חשש גובר כי מולקולות אלה יכולות להיכנס לשרשרת המזון באמצעות שפכים וייצור חקלאי, ובכך להשפיע על בריאותם של בעלי חיים ובני אדם 5,6,7.
אחד האתגרים המשמעותיים בהתמודדות עם בעיה זו הוא המספר העצום של תרכובות המעורבות, כולל מולקולות מאושרות וכבר אסורות, אך עדיין קיימות בהתמדה. בשנים האחרונות נעשו מאמצים ניכרים לפתח מערכות בדיקה לסינון וזיהוי הפוטנציאל המשבש של כימיקלים שונים 8,9,10,11. בעוד שיטות אלה מצטיינות בסינון תפוקה גבוהה של אלפי תרכובות וזיהוי איומים פוטנציאליים, ניתוח מפורט של השפעות in vivo ספציפיות של מולקולות אלה חיוני כדי לקבוע את הסיכונים של חשיפה אנושית. לפיכך, גישה רבת פנים נחוצה בעת לימוד ואפיון כימיקלים משבשי אנדוקרינית (EDC).
בהקשר של רגולציית TH, הבנת ההשלכות הספציפיות לרקמות של חשיפה ל-EDC דורשת כימות של פעולת TH מקומית. למרות שמספר מודלים in vivo פותחו למטרה זו, רובם מסתמכים על סמנים אנדוגניים כמדד התפוקה שלהם. למרות היותם פיזיולוגיים, סמנים אלה כפופים למנגנוני ויסות רבים, ישירים ועקיפים, מה שהופך את הפרשנות שלהם למאתגרת יותר. לכן, אפיון השפעות EDC על ויסות TH ברמת הרקמה נותר אתגר משמעותי12,13.
כדי להתמודד עם האתגרים של מדידת איתות TH ספציפי לרקמות, פותח לאחרונה מודל העכבר Thyroid Hormone Action Indicator (THAI). מודל זה מאפשר כימות ספציפי של שינויים בפעולת TH מקומית בתנאים אנדוגניים. טרנסגן לוציפראז הוכנס לגנום העכבר, הרגיש מאוד לוויסות על ידי פעולת TH14. מודל זה הוכיח יעילות במענה על שאלות מחקר שונות הדורשות כימות שינויים באיתות TH מקומי ברקמה 14,15,16,17,18.
זיהוי אחד של שימוש פוטנציאלי במודל THAI הוא אפיון השפעות ספציפיות לרקמות של EDCs על איתות TH. המודל שימש לאחרונה בהצלחה כדי לחקור את ההשפעות הספציפיות לרקמות של tetrabromobisphenol A ו diclazuril על איתות TH15. כאן, פרוטוקולים בסיסיים מוצגים לשימוש בטכניקות הדמיה in vivo במודל THAI כמערכת בדיקה לאפיון EDCs המשבשים את תפקוד TH. שיטה זו ממנפת את האופי הביו-לומינסנטי של תגובת לוציפרין-לוציפראז. בעיקרו של דבר, האנזים לוציפראז המתבטא באופן טרנסגני מזרז את החמצון של לוציפרין המנוהל, ומייצר אור זוהר פרופורציונלי לכמות הלוציפראז ברקמה (איור 1). כתוצאה מכך, התגובה הביולוגית שנמדדה היא פעילות לוציפראז, שאומתה כמדד מתאים לפעולת TH מקומית14. בעוד שהמודל התאילנדי ישים לכימות פעולת TH כמעט בכל הרקמות, הדמיית in vivo מתמקדת בעיקר בפעולת TH במעי הדק (הדמיה גחון) וברקמת השומן החומה הבין-סקפולרית (BAT, הדמיה גבית)14.
יתרון משמעותי של טכניקת ההדמיה in vivo הוא שהיא מבטלת את הצורך להקריב בעלי חיים עבור מדידות. זה מאפשר לחוקרים לתכנן ניסויי אורך ומעקב כמחקרים בשליטה עצמית, תוך הפחתת ההטיות בין הנבדקים ומספר בעלי החיים בשימוש. היבט זה חיוני במיוחד באפיון EDC, ועוצמתה ורבגוניותה של השיטה למטרה זו הודגמו בעבר14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
האיומים שמציבים כימיקלים משבשים אנדוקריניים (EDC) לבריאות האדם מוכרים היטב; עם זאת, המחקר על EDCs עומד בפני אתגרים עצומים. אתגרים אלה הם בחלקם תוצאה של המורכבות של המערכת האנדוקרינית. EDCs רבים זוהו כמשבשים בו זמנית מערכות אנדוקריניות מרובות22. בנוסף, בהקשר של כלכלת הורמון בלוטת התר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על-ידי פרויקט מס’. RRF-2.3.1-21-2022-00011, שכותרתו המעבדה הלאומית למדעי המוח התרגומי יושמה בתמיכה הניתנת על ידי מתקן ההתאוששות והחוסן של האיחוד האירופי במסגרת תוכנית Széchenyi Plan Plus.
Materials
| 3,5,3'-triiodothyronine (T3) | Merck | T2877 | |
| Animals, mice | THAI mouse | ||
| Eye protection gel | Oculotect | 1000 IU/g | |
| Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | 50 mL volume | |
| Iodine-free chow diet | Research Diets | custom | |
| IVIS Lumina II in vivo imaging system | Perkin Elmer | – | |
| Ketamine | Vetcentre | E1857 | |
| Living Image software 4.5 | Perkin Elmer | – | provided with the instrument |
| Measuring cylinder | 250 mL | ||
| methimazole | Merck | M8506 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | For diluting treatment materials | |
| NaClO4 | Merck | 71852 | |
| Na-luciferin, substrate | Goldbio | 103404-75-7 | |
| NaOH | Merck | 101052833 | |
| Phoshphate buffer saline | Chem Cruz | sc-362302 | |
| Pipette | Gilson | For diluting treatment materials | |
| Pipette tips | Axygen | For diluting treatment materials | |
| Shaving cream/epilator/shaver | Personal preference | ||
| Syringe | B Braun | 1 mL volume | |
| Syringe needle | B Braun | 0.3 x 12 mm | |
| Xylazine | Vetcentre | E1852 |
References
- Larsen, P. R., Davies, T. F., Hay, I. D., Wilson, J. D., Foster, D. W., Kronenberg, H. M., Larsen, P. R. . Williams Textbook of Endocrinology. , 389-515 (1998).
- Gereben, B., et al. Cellular and molecular basis of deiodinase-regulated thyroid hormone signaling. Endocr Rev. 29 (7), 898-938 (2008).
- Fekete, C., Lechan, R. M. Central regulation of hypothalamic-pituitary-thyroid axis under physiological and pathophysiological conditions. Endocr Rev. 35 (2), 159-194 (2014).
- Bianco, A. C., et al. Paradigms of Dynamic Control of Thyroid Hormone Signaling. Endocr Rev. 40 (4), 1000-1047 (2019).
- Zoeller, R. T. Endocrine disrupting chemicals and thyroid hormone action. Adv Pharmacol. 92, 401-417 (2021).
- Guarnotta, V., Amodei, R., Frasca, F., Aversa, A., Giordano, C. Impact of chemical endocrine disruptors and hormone modulators on the endocrine system. Int J Mol Sci. 23 (10), 5710 (2022).
- La Merrill, M. A., et al. Consensus on the key characteristics of endocrine-disrupting chemicals as a basis for hazard identification. Nat Rev Endocrinol. 16 (1), 45-57 (2020).
- Fini, J. B., et al. An in vivo multiwell-based fluorescent screen for monitoring vertebrate thyroid hormone disruption. Environ Sci Technol. 41 (16), 5908-5914 (2007).
- Mughal, B. B., Fini, J. B., Demeneix, B. A. Thyroid-disrupting chemicals and brain development: an update. Endocr Connect. 7 (4), 160-186 (2018).
- Dong, M., Li, Y., Zhu, M., Li, J., Qin, Z. Tetrabromobisphenol a disturbs brain development in both thyroid hormone-dependent and -independent manners in xenopus laevis. Molecules. 27 (1), 249 (2021).
- Beck, K. R., Sommer, T. J., Schuster, D., Odermatt, A. Evaluation of tetrabromobisphenol A effects on human glucocorticoid and androgen receptors: A comparison of results from human- with yeast-based in vitro assays. Toxicology. 370, 70-77 (2016).
- Li, J., Li, Y., Zhu, M., Song, S., Qin, Z. A multiwell-based assay for screening thyroid hormone signaling disruptors using thibz expression as a sensitive endpoint in xenopus laevis. Molecules. 27 (3), 798 (2022).
- Myosho, T., et al. Preself-feeding medaka fry provides a suitable screening system for in vivo assessment of thyroid hormone-disrupting potential. Environ Sci Technol. 56 (10), 6479-6490 (2022).
- Mohacsik, P., et al. A Transgenic mouse model for detection of tissue-specific thyroid hormone action. Endocrinology. 159 (2), 1159-1171 (2018).
- Sinko, R., et al. Tetrabromobisphenol A and diclazuril evoke tissue-specific changes of thyroid hormone signaling in male thyroid hormone action indicator Mice. Int J Mol Sci. 23 (23), 14782 (2022).
- Sinko, R., et al. Different hypothalamic mechanisms control decreased circulating thyroid hormone levels in infection and fasting-induced non-thyroidal illness syndrome in male thyroid hormone action indicator mice. Thyroid. 33 (1), 109-118 (2023).
- Salas-Lucia, F., et al. Axonal T3 uptake and transport can trigger thyroid hormone signaling in the brain. Elife. 12, 82683 (2023).
- Liu, S., et al. Triiodothyronine (T3) promotes brown fat hyperplasia via thyroid hormone receptor alpha mediated adipocyte progenitor cell proliferation. Nat Commun. 13 (1), 3394 (2022).
- Bianco, A. C., et al. American thyroid association guide to investigating thyroid hormone economy and action in rodent and cell models. Thyroid. 24 (1), 88-168 (2014).
- Silva, J. E., Larsen, P. R. Adrenergic activation of triiodothyronine production in brown adipose tissue. Nature. 305 (5936), 712-713 (1983).
- Bianco, A. C., Silva, J. E. Intracellular conversion of thyroxine to triiodothyronine is required for the optimal thermogenic function of brown adipose tissue. J Clin Invest. 79 (1), 295-300 (1987).
- Caporale, N., et al. From cohorts to molecules: Adverse impacts of endocrine disrupting mixtures. Science. 375 (6582), 8244 (2022).
