Tiroid Hormon Etki Göstergesi Fare ile Endokrin Bozucu Kimyasal Etkilerin İn vivo Karakterizasyonu
Summary
Tiroid Hormon Etki Göstergesi fare modeli, endojen düzenleyici mekanizmasını kullanarak lokal tiroid hormon etkisinin dokuya özgü nicelleştirilmesini sağlamak için geliştirilmiştir. Son zamanlarda, modelin tiroid hormon ekonomisi ile etkileşime giren endokrin bozucu kimyasalları hem ex vivo hem de in vivo metodolojilerle karakterize etmek için uygun olduğu gösterilmiştir.
Abstract
Tiroid hormonları (TH) hücre metabolizmasında ve doku fonksiyonunda kritik bir rol oynar. TH ekonomisi, hormon üretimini veya etkisini bozabilecek endokrin bozucu kimyasallara (EDC’ler) karşı hassastır. Birçok çevresel kirletici, hem insan sağlığı hem de tarımsal üretim için ortaya çıkan bir tehdidi temsil eden EDC’lerdir. Bu, potansiyel EDC’lerin etkilerini incelemek için uygun test sistemlerine olan talebin artmasına neden olmuştur. Bununla birlikte, mevcut metodolojiler zorluklarla karşı karşıyadır. Çoğu test sistemi, doğrudan ve dolaylı etkilerin ayırt edilmesini zorlaştıran çoklu, genellikle karmaşık düzenleyici süreçler tarafından düzenlenen endojen belirteçler kullanır. Ayrıca, in vitro test sistemleri, memelilerde EDC metabolizmasının ve farmakokinetiğin fizyolojik karmaşıklığından yoksundur. Ek olarak, çevresel EDC’lere maruz kalma genellikle in vivo üretilen metabolitler de dahil olmak üzere çoklu bileşiklerin bir karışımını içerir, bu nedenle etkileşim olasılığı göz ardı edilemez. Bu karmaşıklık, EDC karakterizasyonunu zorlaştırır. Tiroid Hormon Etki Göstergesi (THAI) faresi, dokuya özgü TH etkisinin değerlendirilmesini sağlayan, TH’ye duyarlı bir lusiferaz raportör sistemi taşıyan transgenik bir modeldir. Doku örneklerinde lusiferaz raportör ekspresyonunu ölçerek kimyasalların lokal TH etkisi üzerindeki dokuya özgü etkileri değerlendirilebilir. Ayrıca, in vivo görüntüleme ile THAI fare modeli, canlı hayvanlarda potansiyel EDC’lerin etkileri üzerine uzunlamasına çalışmalara izin verir. Bu yaklaşım, aynı hayvanda zaman içinde lokal TH etkisindeki değişikliklerin değerlendirilmesini sağladığından, uzun süreli maruziyeti, karmaşık tedavi yapılarını veya geri çekilmeyi test etmek için güçlü bir araç sağlar. Bu rapor, THAI fareleri üzerinde in vivo görüntüleme ölçümlerinin sürecini açıklamaktadır. Burada tartışılan protokol, kontrol görevi görebilecek hiper ve hipotiroidi farelerin geliştirilmesine ve görüntülenmesine odaklanmaktadır. Araştırmacılar, özel ihtiyaçlarını karşılamak için sunulan tedavileri uyarlayabilir veya genişletebilir ve daha fazla araştırma için temel bir yaklaşım sunabilir.
Introduction
Tiroid hormonu (TH) sinyali, yetişkinlikte normal gelişim ve optimal doku fonksiyonu için gerekli olan hücresel metabolizmanın temel bir düzenleyicisidir1. Dokular içinde, TH eylemi, yerel TH seviyelerinin dokuya özgü bakımına izin veren karmaşık bir moleküler makine tarafından hassas bir şekilde kontrol edilir. Farklı dokuların dolaşımdaki TH seviyelerinden bu özerkliği büyük önem taşımaktadır 2,3,4.
Çok sayıda kimyasal, endokrin fonksiyonlarını bozma potansiyeline sahiptir ve çevrede kirletici olarak bulunur. Bu moleküllerin atık su ve tarımsal üretim yoluyla besin zincirine girebileceği ve böylece çiftlik hayvanlarının ve insanların sağlığını etkileyebileceği giderek artan bir endişe kaynağıdır 5,6,7.
Bu konuyu ele almadaki önemli zorluklardan biri, hem yetkilendirilmiş hem de halihazırda yasaklanmış, ancak hala ısrarla mevcut olan moleküller de dahil olmak üzere, ilgili çok sayıda bileşiktir. Son yıllarda, çeşitli kimyasalların tarama ve yıkıcı potansiyelinin belirlenmesi için test sistemleri geliştirmek için önemli çabalar sarf edilmiştir8,9,10,11. Bu yöntemler, binlerce bileşiğin yüksek verimli taranmasında ve potansiyel tehditlerin belirlenmesinde mükemmel olsa da, bu moleküllerin spesifik in vivo etkilerinin ayrıntılı bir analizi, insan maruziyetinin tehlikelerini belirlemek için esastır. Bu nedenle, endokrin bozucu kimyasalları (EDC’ler) incelerken ve karakterize ederken çok yönlü bir yaklaşım gereklidir.
TH regülasyonu bağlamında, EDC maruziyetinin dokuya özgü sonuçlarını anlamak, lokal TH eyleminin ölçülmesini gerektirir. Bu amaç için birkaç in vivo model geliştirilmiş olsa da, çoğu çıktı ölçüsü olarak endojen belirteçlere güvenir. Fizyolojik olmalarına rağmen, bu belirteçler hem doğrudan hem de dolaylı olarak çok sayıda düzenleyici mekanizmaya tabidir ve bu da yorumlanmalarını daha zor hale getirir. Bu nedenle, EDC’nin doku düzeyinde TH regülasyonu üzerindeki etkilerini karakterize etmek önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir12,13.
Dokuya özgü TH sinyalini ölçmenin zorluklarını ele almak için, Tiroid Hormon Eylem Göstergesi (THAI) fare modeli yakın zamanda geliştirilmiştir. Bu model, endojen koşullar altında lokal TH etkisindeki değişikliklerin spesifik olarak ölçülmesine izin verir. Fare genomuna, TH eylemi14 tarafından düzenlemeye oldukça duyarlı olan bir lusiferaz transgeni sokuldu. Bu model,14,15,16,17,18 sinyalini veren lokal doku TH değişikliklerinin ölçülmesini gerektiren çeşitli araştırma sorularını yanıtlamada etkinlik göstermiştir.
THAI modelinin potansiyel bir kullanımının tanınması, EDC’lerin TH sinyali üzerindeki dokuya özgü etkilerini karakterize etmektir. Model, tetrabromobisfenol A ve diclazuril’in TH sinyal15 üzerindeki dokuya özgü etkilerini araştırmak için son zamanlarda başarıyla kullanılmıştır. Burada, TH fonksiyonunu bozan EDC’leri karakterize etmek için bir test sistemi olarak THAI modelinde in vivo görüntüleme tekniklerini kullanmak için temel protokoller sunulmaktadır. Bu yöntem, lusiferin-lusiferaz reaksiyonunun biyolüminesan doğasından yararlanır. Esasen, transgenik olarak eksprese edilen lusiferaz enzimi, uygulanan lusiferinin oksidasyonunu katalize eder ve dokudaki lusiferaz miktarıyla orantılı ışıldayan ışık üretir (Şekil 1). Sonuç olarak, ölçülen biyolojik yanıt, lokal TH eyleminin14 uygun bir ölçüsü olarak doğrulanan lusiferaz aktivitesidir. THAI modeli hemen hemen tüm dokularda TH etkisini ölçmek için uygulanabilirken, in vivo görüntüleme öncelikle ince bağırsakta (ventral görüntüleme) ve interskapular kahverengi yağ dokusunda (BAT, dorsal görüntüleme) TH etkisine odaklanır14.
İn vivo görüntüleme tekniğinin önemli bir avantajı, ölçümler için hayvanları feda etme ihtiyacını ortadan kaldırmasıdır. Bu, araştırmacıların kendi kendini kontrol eden çalışmalar olarak uzunlamasına ve takip deneyleri tasarlamasına olanak tanıyarak, denekler arasındaki önyargıyı ve kullanılan hayvan sayısını azaltır. Bu husus özellikle EDC karakterizasyonunda çok önemlidir ve yöntemin bu amaç için gücü ve çok yönlülüğü daha önce gösterilmiştir14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endokrin Bozucu Kimyasalların (EDC’ler) insan sağlığına yönelik tehditleri iyi bilinmektedir; bununla birlikte, EDC’ler üzerine yapılan araştırmalar zorlu zorluklarla karşı karşıyadır. Bu zorluklar kısmen endokrin sistemin karmaşıklığının bir sonucudur. Birçok EDC’nin aynı anda birden fazla endokrin sistemi bozduğu tespit edilmiştir22. Ek olarak, Tiroid Hormonu (TH) ekonomisi bağlamında, TH etkisinin düzenlenmesinde dokuya özgü farklılıklar nedeniyle ek bir karmaş…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Proje no. Ulusal Translasyonel Sinirbilim Laboratuvarı başlıklı RRF-2.3.1-21-2022-00011, Széchenyi Plan Plus Programı çerçevesinde Avrupa Birliği Kurtarma ve Dayanıklılık Tesisi tarafından sağlanan destekle hayata geçirilmiştir.
Materials
| 3,5,3'-triiodothyronine (T3) | Merck | T2877 | |
| Animals, mice | THAI mouse | ||
| Eye protection gel | Oculotect | 1000 IU/g | |
| Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | 50 mL volume | |
| Iodine-free chow diet | Research Diets | custom | |
| IVIS Lumina II in vivo imaging system | Perkin Elmer | – | |
| Ketamine | Vetcentre | E1857 | |
| Living Image software 4.5 | Perkin Elmer | – | provided with the instrument |
| Measuring cylinder | 250 mL | ||
| methimazole | Merck | M8506 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | For diluting treatment materials | |
| NaClO4 | Merck | 71852 | |
| Na-luciferin, substrate | Goldbio | 103404-75-7 | |
| NaOH | Merck | 101052833 | |
| Phoshphate buffer saline | Chem Cruz | sc-362302 | |
| Pipette | Gilson | For diluting treatment materials | |
| Pipette tips | Axygen | For diluting treatment materials | |
| Shaving cream/epilator/shaver | Personal preference | ||
| Syringe | B Braun | 1 mL volume | |
| Syringe needle | B Braun | 0.3 x 12 mm | |
| Xylazine | Vetcentre | E1852 |
References
- Larsen, P. R., Davies, T. F., Hay, I. D., Wilson, J. D., Foster, D. W., Kronenberg, H. M., Larsen, P. R. . Williams Textbook of Endocrinology. , 389-515 (1998).
- Gereben, B., et al. Cellular and molecular basis of deiodinase-regulated thyroid hormone signaling. Endocr Rev. 29 (7), 898-938 (2008).
- Fekete, C., Lechan, R. M. Central regulation of hypothalamic-pituitary-thyroid axis under physiological and pathophysiological conditions. Endocr Rev. 35 (2), 159-194 (2014).
- Bianco, A. C., et al. Paradigms of Dynamic Control of Thyroid Hormone Signaling. Endocr Rev. 40 (4), 1000-1047 (2019).
- Zoeller, R. T. Endocrine disrupting chemicals and thyroid hormone action. Adv Pharmacol. 92, 401-417 (2021).
- Guarnotta, V., Amodei, R., Frasca, F., Aversa, A., Giordano, C. Impact of chemical endocrine disruptors and hormone modulators on the endocrine system. Int J Mol Sci. 23 (10), 5710 (2022).
- La Merrill, M. A., et al. Consensus on the key characteristics of endocrine-disrupting chemicals as a basis for hazard identification. Nat Rev Endocrinol. 16 (1), 45-57 (2020).
- Fini, J. B., et al. An in vivo multiwell-based fluorescent screen for monitoring vertebrate thyroid hormone disruption. Environ Sci Technol. 41 (16), 5908-5914 (2007).
- Mughal, B. B., Fini, J. B., Demeneix, B. A. Thyroid-disrupting chemicals and brain development: an update. Endocr Connect. 7 (4), 160-186 (2018).
- Dong, M., Li, Y., Zhu, M., Li, J., Qin, Z. Tetrabromobisphenol a disturbs brain development in both thyroid hormone-dependent and -independent manners in xenopus laevis. Molecules. 27 (1), 249 (2021).
- Beck, K. R., Sommer, T. J., Schuster, D., Odermatt, A. Evaluation of tetrabromobisphenol A effects on human glucocorticoid and androgen receptors: A comparison of results from human- with yeast-based in vitro assays. Toxicology. 370, 70-77 (2016).
- Li, J., Li, Y., Zhu, M., Song, S., Qin, Z. A multiwell-based assay for screening thyroid hormone signaling disruptors using thibz expression as a sensitive endpoint in xenopus laevis. Molecules. 27 (3), 798 (2022).
- Myosho, T., et al. Preself-feeding medaka fry provides a suitable screening system for in vivo assessment of thyroid hormone-disrupting potential. Environ Sci Technol. 56 (10), 6479-6490 (2022).
- Mohacsik, P., et al. A Transgenic mouse model for detection of tissue-specific thyroid hormone action. Endocrinology. 159 (2), 1159-1171 (2018).
- Sinko, R., et al. Tetrabromobisphenol A and diclazuril evoke tissue-specific changes of thyroid hormone signaling in male thyroid hormone action indicator Mice. Int J Mol Sci. 23 (23), 14782 (2022).
- Sinko, R., et al. Different hypothalamic mechanisms control decreased circulating thyroid hormone levels in infection and fasting-induced non-thyroidal illness syndrome in male thyroid hormone action indicator mice. Thyroid. 33 (1), 109-118 (2023).
- Salas-Lucia, F., et al. Axonal T3 uptake and transport can trigger thyroid hormone signaling in the brain. Elife. 12, 82683 (2023).
- Liu, S., et al. Triiodothyronine (T3) promotes brown fat hyperplasia via thyroid hormone receptor alpha mediated adipocyte progenitor cell proliferation. Nat Commun. 13 (1), 3394 (2022).
- Bianco, A. C., et al. American thyroid association guide to investigating thyroid hormone economy and action in rodent and cell models. Thyroid. 24 (1), 88-168 (2014).
- Silva, J. E., Larsen, P. R. Adrenergic activation of triiodothyronine production in brown adipose tissue. Nature. 305 (5936), 712-713 (1983).
- Bianco, A. C., Silva, J. E. Intracellular conversion of thyroxine to triiodothyronine is required for the optimal thermogenic function of brown adipose tissue. J Clin Invest. 79 (1), 295-300 (1987).
- Caporale, N., et al. From cohorts to molecules: Adverse impacts of endocrine disrupting mixtures. Science. 375 (6582), 8244 (2022).
