Este protocolo descreve métodos para preparar células de fibras periféricas, maduras e nucleares do cristalino ocular para coloração por imunofluorescência para estudar interdigitações complexas célula-célula e a arquitetura da membrana.
O cristalino é um órgão transparente e elipsoide na câmara anterior do olho que muda de forma para focalizar finamente a luz na retina para formar uma imagem clara. A maior parte desse tecido é composta por células fibrosas especializadas e diferenciadas que possuem secção transversal hexagonal e se estendem dos polos anterior para posterior do cristalino. Essas células longas e magras são fortemente opostas às células vizinhas e têm interdigitações complexas ao longo do comprimento da célula. As estruturas intertravadas especializadas são necessárias para as propriedades biomecânicas normais do cristalino e têm sido extensivamente descritas usando técnicas de microscopia eletrônica. Este protocolo demonstra o primeiro método para preservar e imunomanchar singular, bem como feixes de células de fibra de lente de camundongo para permitir a localização detalhada de proteínas dentro dessas células de forma complexa. Os dados representativos mostram a coloração das células periféricas, diferenciadoras, maduras e de fibras nucleares em todas as regiões do cristalino. Este método pode ser potencialmente utilizado em células de fibras isoladas de lentes de outras espécies.
O cristalino é um tecido límpido e ovoide, na câmara anterior do olho, composto por dois tipos celulares, células epiteliais efibras1 (Figura 1). Existe uma monocamada de células epiteliais que recobre o hemisfério anterior do cristalino. As células fibrosas são diferenciadas das células epiteliais e compõem a maior parte do cristalino. As células fibrosas altamente especializadas sofrem uma programação de alongamento, diferenciação e maturação, marcada por distintas mudanças na morfologia da membrana celular da periferia do cristalino para o centro do cristalino2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , também conhecido como núcleo do cristalino. A função do cristalino de focalizar a luz vinda de várias distâncias para a retina depende de suas propriedades biomecânicas, incluindo rigidez e elasticidade 13,14,15,16,17,18,19. As complexas interdigitações das fibras do cristalino foram hipotetizadas 20,21 e recentemente mostraram-se importantes para a rigidez do cristalino 22,23.
Figura 1: Diagramas de anatomia do cristalino e imagens representativas de microscopia eletrônica de varredura (MEV) das fibras do cristalino. O desenho mostra uma visão longitudinal (anterior a posterior de cima para baixo) da monocamada anterior de células epiteliais (sombreada em azul claro) e uma massa volumosa de células de fibra do cristalino (branco). O centro da lente (sombreado em rosa) é conhecido como núcleo e compreende células de fibra altamente compactadas. À direita, um desenho animado de seção transversal revela a forma de célula hexagonal alongada das fibras da lente que são embaladas em um padrão de favo de mel. As células de fibra têm dois lados largos e quatro lados curtos. Imagens SEM representativas ao longo da parte inferior mostram as interdigitações complexas da membrana entre as células de fibra da lente em diferentes profundidades da lente. A partir da direita, as fibras de lente recém-formadas na periferia da lente têm pequenas saliências ao longo dos lados curtos e bolas e soquetes ao longo do lado largo (caixas vermelhas). Durante a maturação, as fibras do cristalino desenvolvem grandes domínios de remo que são decorados por pequenas saliências ao longo dos lados curtos (caixas azuis). As células de fibras maduras possuem grandes domínios de pás ilustrados por pequenas saliências. Esses domínios de intertravamento são importantes para as propriedades biomecânicas das lentes. As células de fibra no núcleo do cristalino têm menos pequenas saliências ao longo de seus lados curtos e têm interdigitações complexas de língua e sulco (caixas roxas). Os lados largos da célula exibem uma morfologia de membrana globular. O desenho foi modificado de22,32 e não desenhado em escala. Barra de escala = 3 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A lente cresce pela adição de conchas de novas células de fibra sobrepostas às gerações anteriores de fibras24,25. As células de fibra têm uma forma de seção transversal hexagonal alongada com dois lados largos e quatro lados curtos. Essas células se estendem do polo anterior ao posterior do cristalino e, dependendo da espécie, as fibras do cristalino podem ter vários milímetros de comprimento. Para suportar a estrutura dessas células alongadas e magras, interdigitações especializadas ao longo dos lados largos e curtos criam estruturas interligadas para manter a forma da lente e as propriedades biomecânicas. Alterações na forma da membrana celular durante a diferenciação e maturação das células fibrosas têm sido extensivamente documentadas por estudos de microscopia eletrônica (ME)2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . As células de fibra recém-formadas têm bolas e soquetes ao longo de seus lados largos com saliências muito pequenas ao longo de seus lados curtos, enquanto as fibras maduras têm saliências e pás interligadas ao longo de seus lados curtos. As fibras nucleares exibem interdigitações de língua e sulco e morfologia da membrana globular. Pouco se sabe sobre as proteínas necessárias para essas complexas membranas interligadas. Estudos prévios sobre a localização de proteínas em células fibrosas basearam-se em cortes de tecido do cristalino, que não permitem uma visualização clara da arquitetura celular complexa.
Este trabalho criou e aperfeiçoou um novo método para fixar células de fibras simples e em feixes de lentes para preservar a morfologia complexa e permitir a imunomarcação de proteínas na membrana celular e dentro do citoplasma. Este método preserva fielmente a arquitetura da membrana celular, comparável aos dados de estudos de EM, e permite a coloração com anticorpos primários para proteínas específicas. Temos previamente imunomarcadas fibras corticais do cristalino em fase de diferenciação ematuração22,23. Neste protocolo, há também um novo método para corar células de fibra do núcleo do cristalino. Este protocolo abre as portas para a compreensão dos mecanismos de formação e mudanças nas interdigitações da membrana durante a maturação das células fibrosas e compactação do núcleo do cristalino.
Este protocolo demonstrou os métodos de fixação, preservação e imunomarcação que preservam fielmente a morfologia da membrana 3D de feixes ou células de fibras do cristalino singular de várias profundidades no cristalino. As fibras coradas do cristalino são comparadas com preparações de MEV que têm sido usadas há muito tempo para estudar a morfologia das células das fibras do cristalino. Os resultados mostram estruturas de membrana comparáveis entre as duas preparações. A ME continua sendo o padrão-our…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo processo R01 EY032056 (para CC) do Instituto Nacional de Olhos. Os autores agradecem à Dra. Theresa Fassel e Kimberly Vanderpool do Scripps Research Core Microscopy Facility por sua assistência com as imagens do microscópio eletrônico.
100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
Nail polish | |||
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
Primary antibody | |||
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
Secondary antibody | |||
Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |