Dit protocol beschrijft methoden om perifere, volwassen en nucleaire ooglensvezelcellen voor te bereiden op immunofluorescentiekleuring om complexe cel-tot-cel-interdigitaties en de membraanarchitectuur te bestuderen.
De lens is een transparant en ellipsoïde orgaan in de voorste oogkamer dat van vorm verandert om het licht fijn op het netvlies te richten om een helder beeld te vormen. Het grootste deel van dit weefsel bestaat uit gespecialiseerde, gedifferentieerde vezelcellen die een zeshoekige doorsnede hebben en zich uitstrekken van de voorste tot de achterste polen van de lens. Deze lange en dunne cellen staan sterk tegenover naburige cellen en hebben complexe interdigitaties over de lengte van de cel. De gespecialiseerde in elkaar grijpende structuren zijn vereist voor normale biomechanische eigenschappen van de lens en zijn uitgebreid beschreven met behulp van elektronenmicroscopietechnieken. Dit protocol demonstreert de eerste methode om enkelvoud en bundels van muizenlensvezelcellen te behouden en te immunokleuren om de gedetailleerde lokalisatie van eiwitten in deze complex gevormde cellen mogelijk te maken. De representatieve gegevens tonen kleuring van de perifere, differentiërende, rijpe en nucleaire vezelcellen in alle regio’s van de lens. Deze methode kan mogelijk worden gebruikt op vezelcellen die zijn geïsoleerd uit lenzen van andere soorten.
De lens is een helder en eivormig weefsel in de voorste oogkamer dat bestaat uit twee celtypen, epitheel- en vezelcellen 1 (Figuur 1). Er is een monolaag van epitheelcellen die de voorste hemisfeer van de lens bedekt. Vezelcellen worden onderscheiden van epitheelcellen en vormen het grootste deel van de lens. De zeer gespecialiseerde vezelcellen ondergaan een verlenging, differentiatie en rijpingsprogrammering, gekenmerkt door duidelijke veranderingen in de morfologie van het celmembraan van de lensperiferie naar het lenscentrum 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , ook wel bekend als de lenskern. De functie van de lens om licht dat van verschillende afstanden op het netvlies komt fijn te focussen, hangt af van de biomechanische eigenschappen ervan, waaronder stijfheid en elasticiteit 13,14,15,16,17,18,19. De complexe interdigitaties van lensvezels zijn verondersteld20,21 en onlangs is aangetoond dat ze belangrijk zijn voor lensstijfheid22,23.
Figuur 1: Lensanatomiediagrammen en representatieve scanning-elektronenmicroscopie (SEM)-beelden van lensvezels. De cartoon toont een longitudinaal (van voren naar achteren van boven naar beneden) weergave van de voorste monolaag van epitheelcellen (lichtblauw gearceerd) en een bulkmassa lensvezelcellen (wit). Het midden van de lens (roze gearceerd) staat bekend als de kern en bestaat uit sterk verdichte vezelcellen. Aan de rechterkant onthult een cartoon met dwarsdoorsnede de langwerpige zeshoekige celvorm van lensvezels die in een honingraatpatroon zijn verpakt. Vezelcellen hebben twee brede zijden en vier korte zijden. Representatieve SEM-beelden langs de onderkant tonen de complexe membraaninterdigitaties tussen lensvezelcellen op verschillende diepten van de lens. Van rechts hebben nieuw gevormde lensvezels aan de rand van de lens kleine uitsteeksels langs de korte zijden en kogels langs de brede kant (rode vakken). Tijdens de rijping ontwikkelen lensvezels grote peddeldomeinen die worden versierd met kleine uitsteeksels langs de korte zijden (blauwe vakken). Rijpe vezelcellen bezitten grote peddeldomeinen die worden geïllustreerd door kleine uitsteeksels. Deze in elkaar grijpende domeinen zijn belangrijk voor de biomechanische eigenschappen van lenzen. Vezelcellen in de lenskern hebben minder kleine uitsteeksels langs hun korte zijden en hebben complexe tand-en-groef-interdigitaties (paarse vakken). De brede zijden van de cel vertonen een bolvormige membraanmorfologie. De cartoon is aangepast van22,32 en niet op schaal getekend. Schaalbalk = 3 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De lens groeit door schelpen van nieuwe vezelcellen toe te voegen die bovenop eerdere generaties vezels zijn gelegd24,25. Vezelcellen hebben een langwerpige, zeshoekige dwarsdoorsnedevorm met twee brede zijden en vier korte zijden. Deze cellen strekken zich uit van de voorste tot de achterste pool van de lens en afhankelijk van de soort kunnen de lensvezels enkele millimeters lang zijn. Om de structuur van deze langwerpige en dunne cellen te ondersteunen, creëren gespecialiseerde interdigitaties langs de brede en korte zijden in elkaar grijpende structuren om de vorm van de lens en de biomechanische eigenschappen te behouden. Veranderingen in de vorm van het celmembraan tijdens de differentiatie en rijping van vezelcellen zijn uitgebreid gedocumenteerd door elektronenmicroscopie (EM) studies 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Nieuw gevormde vezelcellen hebben ballen-en-sockets langs hun brede zijden met zeer kleine uitsteeksels langs hun korte zijden, terwijl volwassen vezels in elkaar grijpende uitsteeksels en peddels langs hun korte zijden hebben. Kernvezels vertonen tand-en-groef-interdigitaties en bolvormige membraanmorfologie. Er is weinig bekend over de eiwitten die nodig zijn voor deze complexe in elkaar grijpende membranen. Eerdere studies naar eiwitlokalisatie in vezelcellen waren gebaseerd op lensweefselsecties, die geen duidelijke visualisatie van de complexe celarchitectuur mogelijk maken.
Dit werk heeft een nieuwe methode gecreëerd en geperfectioneerd om enkele en bundels lensvezelcellen te fixeren om de complexe morfologie te behouden en om immunokleuring voor eiwitten op het celmembraan en in het cytoplasma mogelijk te maken. Deze methode behoudt getrouw de celmembraanarchitectuur, vergelijkbaar met gegevens uit EM-studies, en maakt kleuring mogelijk met primaire antilichamen voor specifieke eiwitten. We hebben eerder immunogekleurde corticale lensvezels die differentiatie en rijping ondergaan22,23. In dit protocol is er ook een nieuwe methode om vezelcellen uit de lenskern te kleuren. Dit protocol opent de deur naar het begrijpen van de mechanismen voor vorming en veranderingen in membraaninterdigitaties tijdens de rijping van vezelcellen en de verdichting van de lenskern.
Dit protocol heeft de fixatie-, conserverings- en immunokleuringsmethoden gedemonstreerd die de 3D-membraanmorfologie van bundels of enkelvoudige lensvezelcellen van verschillende diepten in de lens getrouw behouden. De gekleurde lensvezels worden vergeleken met SEM-preparaten die al lang worden gebruikt om de morfologie van lensvezelcellen te bestuderen. De resultaten laten vergelijkbare membraanstructuren zien tussen beide preparaten. EM blijft de gouden standaard voor het bestuderen van celmorfologie, maar immunolabel…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidie R01 EY032056 (aan CC) van het National Eye Institute. De auteurs bedanken Dr. Theresa Fassel en Kimberly Vanderpool van de Scripps Research Core Microscopy Facility voor hun hulp bij de elektronenmicroscoopbeelden.
100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
Nail polish | |||
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
Primary antibody | |||
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
Secondary antibody | |||
Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |