Summary

Voorbereiding en immunofluorescentiekleuring van bundels en enkelvoudige vezelcellen uit de cortex en de kern van de ooglens

Published: June 09, 2023
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft methoden om perifere, volwassen en nucleaire ooglensvezelcellen voor te bereiden op immunofluorescentiekleuring om complexe cel-tot-cel-interdigitaties en de membraanarchitectuur te bestuderen.

Abstract

De lens is een transparant en ellipsoïde orgaan in de voorste oogkamer dat van vorm verandert om het licht fijn op het netvlies te richten om een helder beeld te vormen. Het grootste deel van dit weefsel bestaat uit gespecialiseerde, gedifferentieerde vezelcellen die een zeshoekige doorsnede hebben en zich uitstrekken van de voorste tot de achterste polen van de lens. Deze lange en dunne cellen staan sterk tegenover naburige cellen en hebben complexe interdigitaties over de lengte van de cel. De gespecialiseerde in elkaar grijpende structuren zijn vereist voor normale biomechanische eigenschappen van de lens en zijn uitgebreid beschreven met behulp van elektronenmicroscopietechnieken. Dit protocol demonstreert de eerste methode om enkelvoud en bundels van muizenlensvezelcellen te behouden en te immunokleuren om de gedetailleerde lokalisatie van eiwitten in deze complex gevormde cellen mogelijk te maken. De representatieve gegevens tonen kleuring van de perifere, differentiërende, rijpe en nucleaire vezelcellen in alle regio’s van de lens. Deze methode kan mogelijk worden gebruikt op vezelcellen die zijn geïsoleerd uit lenzen van andere soorten.

Introduction

De lens is een helder en eivormig weefsel in de voorste oogkamer dat bestaat uit twee celtypen, epitheel- en vezelcellen 1 (Figuur 1). Er is een monolaag van epitheelcellen die de voorste hemisfeer van de lens bedekt. Vezelcellen worden onderscheiden van epitheelcellen en vormen het grootste deel van de lens. De zeer gespecialiseerde vezelcellen ondergaan een verlenging, differentiatie en rijpingsprogrammering, gekenmerkt door duidelijke veranderingen in de morfologie van het celmembraan van de lensperiferie naar het lenscentrum 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , ook wel bekend als de lenskern. De functie van de lens om licht dat van verschillende afstanden op het netvlies komt fijn te focussen, hangt af van de biomechanische eigenschappen ervan, waaronder stijfheid en elasticiteit 13,14,15,16,17,18,19. De complexe interdigitaties van lensvezels zijn verondersteld20,21 en onlangs is aangetoond dat ze belangrijk zijn voor lensstijfheid22,23.

Figure 1
Figuur 1: Lensanatomiediagrammen en representatieve scanning-elektronenmicroscopie (SEM)-beelden van lensvezels. De cartoon toont een longitudinaal (van voren naar achteren van boven naar beneden) weergave van de voorste monolaag van epitheelcellen (lichtblauw gearceerd) en een bulkmassa lensvezelcellen (wit). Het midden van de lens (roze gearceerd) staat bekend als de kern en bestaat uit sterk verdichte vezelcellen. Aan de rechterkant onthult een cartoon met dwarsdoorsnede de langwerpige zeshoekige celvorm van lensvezels die in een honingraatpatroon zijn verpakt. Vezelcellen hebben twee brede zijden en vier korte zijden. Representatieve SEM-beelden langs de onderkant tonen de complexe membraaninterdigitaties tussen lensvezelcellen op verschillende diepten van de lens. Van rechts hebben nieuw gevormde lensvezels aan de rand van de lens kleine uitsteeksels langs de korte zijden en kogels langs de brede kant (rode vakken). Tijdens de rijping ontwikkelen lensvezels grote peddeldomeinen die worden versierd met kleine uitsteeksels langs de korte zijden (blauwe vakken). Rijpe vezelcellen bezitten grote peddeldomeinen die worden geïllustreerd door kleine uitsteeksels. Deze in elkaar grijpende domeinen zijn belangrijk voor de biomechanische eigenschappen van lenzen. Vezelcellen in de lenskern hebben minder kleine uitsteeksels langs hun korte zijden en hebben complexe tand-en-groef-interdigitaties (paarse vakken). De brede zijden van de cel vertonen een bolvormige membraanmorfologie. De cartoon is aangepast van22,32 en niet op schaal getekend. Schaalbalk = 3 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De lens groeit door schelpen van nieuwe vezelcellen toe te voegen die bovenop eerdere generaties vezels zijn gelegd24,25. Vezelcellen hebben een langwerpige, zeshoekige dwarsdoorsnedevorm met twee brede zijden en vier korte zijden. Deze cellen strekken zich uit van de voorste tot de achterste pool van de lens en afhankelijk van de soort kunnen de lensvezels enkele millimeters lang zijn. Om de structuur van deze langwerpige en dunne cellen te ondersteunen, creëren gespecialiseerde interdigitaties langs de brede en korte zijden in elkaar grijpende structuren om de vorm van de lens en de biomechanische eigenschappen te behouden. Veranderingen in de vorm van het celmembraan tijdens de differentiatie en rijping van vezelcellen zijn uitgebreid gedocumenteerd door elektronenmicroscopie (EM) studies 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Nieuw gevormde vezelcellen hebben ballen-en-sockets langs hun brede zijden met zeer kleine uitsteeksels langs hun korte zijden, terwijl volwassen vezels in elkaar grijpende uitsteeksels en peddels langs hun korte zijden hebben. Kernvezels vertonen tand-en-groef-interdigitaties en bolvormige membraanmorfologie. Er is weinig bekend over de eiwitten die nodig zijn voor deze complexe in elkaar grijpende membranen. Eerdere studies naar eiwitlokalisatie in vezelcellen waren gebaseerd op lensweefselsecties, die geen duidelijke visualisatie van de complexe celarchitectuur mogelijk maken.

Dit werk heeft een nieuwe methode gecreëerd en geperfectioneerd om enkele en bundels lensvezelcellen te fixeren om de complexe morfologie te behouden en om immunokleuring voor eiwitten op het celmembraan en in het cytoplasma mogelijk te maken. Deze methode behoudt getrouw de celmembraanarchitectuur, vergelijkbaar met gegevens uit EM-studies, en maakt kleuring mogelijk met primaire antilichamen voor specifieke eiwitten. We hebben eerder immunogekleurde corticale lensvezels die differentiatie en rijping ondergaan22,23. In dit protocol is er ook een nieuwe methode om vezelcellen uit de lenskern te kleuren. Dit protocol opent de deur naar het begrijpen van de mechanismen voor vorming en veranderingen in membraaninterdigitaties tijdens de rijping van vezelcellen en de verdichting van de lenskern.

Protocol

Muizen zijn verzorgd op basis van een dierprotocol dat is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Indiana University Bloomington. De muizen die werden gebruikt om representatieve gegevens te genereren, waren controledieren (wildtype) met een C57BL6/J-achtergrond, vrouwelijk en 8-12 weken oud. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen kunnen voor dit experiment worden gebruikt, omdat het zeer onwaarschijnlijk is dat het geslacht van de muizen de uitkomst van het experiment beïnvloedt. <p …

Representative Results

Lensvezelcellen worden bereid uit de lenscortex (differentiërende vezels en rijpe vezels) en de kern, en de cellen worden gekleurd met falloïdine voor F-actine en WGA voor het celmembraan. Een mengsel van bundels cellen of enkelvoudige lensvezels (Figuur 3) wordt waargenomen en in beeld gebracht. Vanuit de lenscortex worden twee soorten cellen gevonden (Figuur 3A). Differentiërende vezelcellen in de periferie van de lens zijn recht, met zeer kleine uitsteekse…

Discussion

Dit protocol heeft de fixatie-, conserverings- en immunokleuringsmethoden gedemonstreerd die de 3D-membraanmorfologie van bundels of enkelvoudige lensvezelcellen van verschillende diepten in de lens getrouw behouden. De gekleurde lensvezels worden vergeleken met SEM-preparaten die al lang worden gebruikt om de morfologie van lensvezelcellen te bestuderen. De resultaten laten vergelijkbare membraanstructuren zien tussen beide preparaten. EM blijft de gouden standaard voor het bestuderen van celmorfologie, maar immunolabel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door subsidie R01 EY032056 (aan CC) van het National Eye Institute. De auteurs bedanken Dr. Theresa Fassel en Kimberly Vanderpool van de Scripps Research Core Microscopy Facility voor hun hulp bij de elektronenmicroscoopbeelden.

Materials

100% Triton X-100 FisherScientific BP151-500
60mm plate FisherScientific FB0875713A
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
10X phosphate buffered saline ThermoFisher 70011-044
1X phosphate buffered saline ThermoFisher 14190136
48-well plate CytoOne CC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm) FisherScientific 12-553-467
Curved tweezers World Precision Instruments 501981
Dissection microscope Carl Zeiss Stereo Discovery V8
Fine tip straight tweezers Electron Microscopy Sciences 72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides FisherScientific 12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software Carl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Phalloidin (rhodamine) ThermoFisher R415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 VWR 76241-186
Secondary antibody
Straight forceps World Precision Instruments 11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) FisherScientific 12-565-154
Ultra-fine scissors World Precision Instruments 501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein) Vector Laboratories FL-1021-5

References

  1. Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).
  2. Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells. The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).
  3. Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).
  4. Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens. Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).
  5. Lo, W. K., Harding, C. V. Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers. Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).
  6. Taylor, V. L., et al. Morphology of the normal human lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (7), 1396-1410 (1996).
  7. Vrensen, G. F. Aging of the human eye lens-a morphological point of view. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).
  8. Vrensen, G. F., Duindam, H. J. Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations. Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).
  9. Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation. Albrecht von Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).
  10. Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).
  11. Zhou, C. J., Lo, W. K. Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells. Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).
  12. Kuwabara, T. The maturation of the lens cell: a morphologic study. Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).
  13. Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G. Stiffness gradient in the crystalline lens. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (9), 1357-1366 (2007).
  14. Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).
  15. Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).
  16. Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).
  17. Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
  18. Glasser, A., Campbell, M. C. Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).
  19. Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).
  20. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
  21. Lo, W. K., et al. Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).
  22. Cheng, C., et al. Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties. Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).
  23. Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).
  24. Kuszak, J. R. The development of lens sutures. Progress in Retinal and Eye Research. 14 (2), 567-591 (1995).
  25. Bassnett, S., Costello, M. J. The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens. Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).
  26. Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice. Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).
  27. Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).
  28. Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).
  29. Cheng, C., et al. EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2 (2022).
  30. Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. Journal of Visualized Experiments. (111), e53986 (2016).
  31. Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E., Saunders, W. B. Anatomy of the eye and orbit. The Eye (Fourth Edition). , 1 (2016).
  32. Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).
  33. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labeling for scanning electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
  34. Goldberg, M. W. High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex. Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).
  35. Hermann, R., Walther, P., Muller, M. Immunogold labeling in scanning electron microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).
  36. Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).

Play Video

Cite This Article
Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens. J. Vis. Exp. (196), e65638, doi:10.3791/65638 (2023).

View Video