В этом протоколе описаны методы подготовки периферических, зрелых и ядерных клеток волокон хрусталика глаза к иммунофлуоресцентному окрашиванию для изучения сложных межклеточных взаимосвязей и мембранной архитектуры.
Хрусталик представляет собой прозрачный эллипсоидный орган в передней камере глаза, который меняет форму, чтобы точно сфокусировать свет на сетчатке и сформировать четкое изображение. Основная часть этой ткани состоит из специализированных дифференцированных волоконных клеток, которые имеют шестиугольное поперечное сечение и простираются от переднего до заднего полюсов хрусталика. Эти длинные и тонкие клетки плотно противостоят соседним клеткам и имеют сложные межпальцевые соединения по длине клетки. Специализированные взаимосвязанные структуры необходимы для нормальных биомеханических свойств хрусталика и были подробно описаны с помощью методов электронной микроскопии. Этот протокол демонстрирует первый метод сохранения и иммуноокрашивания сингулярных клеток, а также пучков волокон хрусталика мыши, что позволяет детально локализовать белки в этих клетках сложной формы. Репрезентативные данные показывают окрашивание периферических, дифференцирующих, зрелых и ядерных волоконных клеток во всех областях хрусталика. Этот метод потенциально может быть использован на волоконных клетках, выделенных из линз других видов.
Хрусталик представляет собой прозрачную яйцевидную ткань в передней камере глаза, состоящую из двух типов клеток: эпителиальных и волоконныхклеток1 (рис. 1). Существует монослой эпителиальных клеток, который покрывает переднее полушарие хрусталика. Волоконные клетки дифференцируются от эпителиальных клеток и составляют основную часть хрусталика. Высокоспециализированные волоконные клетки подвергаются программированию удлинения, дифференцировки и созревания, отмеченному отчетливыми изменениями морфологии клеточной мембраны от периферии хрусталика к центру хрусталика 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , также известный как ядро хрусталика. Функция хрусталика точно фокусировать свет, поступающий с различных расстояний на сетчатку, зависит от его биомеханических свойств, включая жесткость и эластичность 13,14,15,16,17,18,19. Были выдвинуты гипотезы о сложных взаимосвязях волокон хрусталика 20,21 и недавно показано, что они важны для жесткости хрусталика 22,23.
Рисунок 1: Диаграммы анатомии хрусталика и репрезентативные изображения волокон хрусталика методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). На рисунке показан продольный (от переднего к заднему сверху вниз) вид переднего монослоя эпителиальных клеток (заштрихован светло-голубым цветом) и объемной массы клеток хрусталика (белый). Центр хрусталика (заштрихован розовым цветом) известен как ядро и состоит из сильно уплотненных волоконных клеток. Справа на поперечном срезе изображена вытянутая шестиугольная форма ячеек волокон хрусталика, упакованных в сотовый рисунок. Ячейки волокна имеют две широкие стороны и четыре короткие. Репрезентативные СЭМ-изображения вдоль дна показывают сложные мембранные взаимосвязи между клетками волокон хрусталика на разной глубине хрусталика. Справа новообразованные волокна хрусталика на периферии хрусталика имеют небольшие выступы по коротким сторонам и шарико-гнездовые гнезда по широкой стороне (красные прямоугольники). Во время созревания волокна хрусталика развивают крупные лопастные домены, которые украшены небольшими выступами по коротким сторонам (синими прямоугольниками). Зрелые волокнистые клетки обладают большими лопастичными доменами, проиллюстрированными небольшими выступами. Эти взаимосвязанные домены важны для биомеханических свойств линз. Волокнистые клетки в ядре хрусталика имеют меньше мелких выступов вдоль своих коротких сторон и имеют сложные шпунтовые интердигитации (фиолетовые коробочки). На широких сторонах клетки наблюдается морфология шаровой мембраны. Мультфильм был изменен с22,32 и не нарисован в масштабе. Масштабная линейка = 3 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Хрусталик растет за счет добавления оболочек из новых волоконных ячеек, наложенных поверх волокон предыдущих поколений24,25. Ячейки волокна имеют вытянутую, шестиугольную форму поперечного сечения с двумя широкими сторонами и четырьмя короткими сторонами. Эти клетки простираются от переднего до заднего полюса хрусталика, и в зависимости от вида, волокна хрусталика могут быть несколько миллиметров в длину. Чтобы поддерживать структуру этих удлиненных и тонких клеток, специализированные взаимосвязи вдоль широкой и короткой сторон создают взаимосвязанные структуры для поддержания формы хрусталика и биомеханических свойств. Изменения формы клеточной мембраны во время дифференцировки и созревания волоконных клеток были подробно задокументированы исследованиями электронной микроскопии (ЭМ) 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Новообразованные волокнистые клетки имеют шарики и гнезда вдоль своих широких сторон с очень маленькими выступами вдоль коротких сторон, в то время как зрелые волокна имеют взаимосвязанные выступы и лопасти вдоль коротких сторон. Ядерные волокна демонстрируют шпунтовые интердигитации и морфологию глобулярной мембраны. Мало что известно о белках, которые необходимы для этих сложных взаимосвязанных мембран. Предыдущие исследования локализации белков в волоконных клетках основывались на срезах ткани хрусталика, которые не позволяют четко визуализировать сложную клеточную архитектуру.
Эта работа создала и усовершенствовала новый метод фиксации отдельных и пучков клеток волокон хрусталика для сохранения сложной морфологии и обеспечения иммуноокрашивания белков на клеточной мембране и в цитоплазме. Этот метод достоверно сохраняет архитектуру клеточной мембраны, сопоставимую с данными ЭМ-исследований, и позволяет окрашивать первичными антителами к конкретным белкам. Ранее у нас были иммуноокрашенные кортикальные волокна хрусталика, подвергающиеся дифференцировке и созреванию22,23. В этом протоколе также есть новый метод окрашивания клеток волокна из ядра хрусталика. Этот протокол открывает дверь к пониманию механизмов формирования и изменений мембранных интердигитов во время созревания клеток волокна и уплотнения ядра хрусталика.
Этот протокол продемонстрировал методы фиксации, консервации и иммуноокрашивания, которые точно сохраняют морфологию 3D-мембраны пучков или отдельных клеток волокон хрусталика с различной глубины в хрусталике. Окрашенные волокна хрусталика сравниваются с препаратами SEM, которые уже ?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантом R01 EY032056 (CC) от Национального института глаза. Авторы благодарят д-ра Терезу Фассель и Кимберли Вандерпул из Исследовательского центра керновой микроскопии Скриппса за помощь в получении изображений с помощью электронного микроскопа.
100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
Nail polish | |||
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
Primary antibody | |||
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
Secondary antibody | |||
Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |