Purificação por Afinidade de uma Enzima Fibrinolítica de Sipunculus nudus
Summary
Aqui, apresentamos um método de purificação por afinidade de uma enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus que é simples, barato e eficiente.
Abstract
A enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (sFE) é um novo agente fibrinolítico que pode tanto ativar o plasminogênio em plasmina quanto degradar a fibrina diretamente, apresentando grandes vantagens sobre os trombolíticos tradicionais. No entanto, devido à falta de informações estruturais, todos os programas de purificação para sFE são baseados em purificações por cromatografia em várias etapas, que são muito complicadas e caras. Aqui, um protocolo de purificação por afinidade de sFE é desenvolvido pela primeira vez baseado em uma estrutura cristalina de sFE; inclui a preparação da amostra bruta e da coluna de cromatografia de afinidade da matriz lisina/arginina-agarose, purificação por afinidade e caracterização do FE purificado. Seguindo este protocolo, um lote de sFE pode ser purificado dentro de 1 dia. Além disso, a pureza e a atividade do FE purificado aumentam para 92% e 19.200 U/mL, respectivamente. Assim, esta é uma abordagem simples, barata e eficiente para purificação de sFE. O desenvolvimento deste protocolo é de grande importância para a posterior utilização de sFE e outros agentes similares.
Introduction
A trombose é uma grande ameaça à saúde pública, especialmente após a pandemia global de Covid-19 1,2. Clinicamente, muitos ativadores do plasminogênio (APs), como o ativador do plasminogênio tecidual (tPA) e a uroquinase (UK), têm sido amplamente utilizados como trombolíticos. Os APs podem ativar o plasminogênio dos pacientes em plasmina ativa para degradar a fibrina. Assim, sua eficácia trombolítica é fortemente limitada pelo estado plasminogênico dos pacientes 3,4. Os agentes fibrinolíticos, como a plasmina metaloproteinase e a serina plasmina, são outro tipo de trombolítico clínico que também inclui enzimas fibrinolíticas (EG), como a plasmina, que podem dissolver diretamente os coágulos, mas são rapidamente inativados por vários inibidores de plasmina5. Posteriormente, um novo tipo de agente fibrinolítico foi relatado que pode dissolver o trombo não apenas ativando o plasminogênio em plasmina, mas também degradando diretamente a fibrina 6-a enzima fibrinolítica do antigo verme do amendoim Sipunculus nudus (sFE)6. Essa bifunção confere ao sFE outras vantagens em relação aos trombolíticos tradicionais, especialmente em termos de estado anormal do plasminogênio. Comparado a outros fibrinolíticos bifuncionais 7,8,9, o FE apresenta várias vantagens, incluindo segurança, sobre agentes não derivados de alimentos para o desenvolvimento de fármacos, especialmente para drogas orais. Isso porque a biossegurança e a biocompatibilidade de Sipunculus nudus estão bem estabelecidas10.
Assim como outros fibrinolíticos naturais isolados de microrganismos, minhocas e cogumelos, a purificação do FEs de S. nudus é muito complicada e inclui múltiplas etapas, como homogeneização tecidual, precipitação com sulfato de amônio, dessalinização, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica e peneiramento molecular10,11,12. Tal sistema de purificação não depende apenas de habilidades proficientes e materiais caros, mas também requer vários dias para concluir todo o procedimento. Portanto, um simples programa de purificação de sFE é de grande importância para o desenvolvimento posterior de sFE. Felizmente, dois cristais de sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) foram obtidos com sucesso (ver Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2). Através de análises estruturais e experimentos de acoplamento molecular, descobrimos que o núcleo catalítico do sFE poderia se ligar especificamente a alvos contendo resíduos de arginina ou lisina.
Neste trabalho, um sistema de purificação por afinidade foi proposto pela primeira vez, baseado na estrutura cristalina do sFE. Seguindo este protocolo, o FE altamente puro e altamente ativo pôde ser purificado dos extratos brutos em um único estágio de purificação por afinidade. O protocolo aqui desenvolvido não é apenas importante para a preparação em larga escala de FEf, mas também pode ser aplicado para a purificação de outros agentes fibrinolíticos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Devido à indisponibilidade da sequência exata do gene sFE, o FE atualmente utilizado foi extraído de S. nudus fresco 14. Além disso, os procedimentos de purificação da FEs relatados na literatura foram complicados e dispendiosos, pois se basearam em algumas características gerais da FEs, como peso molecular, ponto isoelétrico, força iônica e polaridade15,16. Nenhum protocolo de purificação de afinidade de FEs foi relat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Cidade de Xiamen (3502Z20227197) e pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Fujian (No. 2019J01070, No.2021Y0027).
Materials
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
- von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
- Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
- Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
- Ge, Y. -. H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
- Choi, J. -. H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -. J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
- Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
- Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
- . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019)
- Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
- Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
- Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
- Wiman, B. Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin. The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).
- Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
- Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
- Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
- Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).
