Аффинная очистка фибринолитического фермента из Sipunculus nudus
Summary
Здесь мы представляем метод аффинной очистки фибринолитического фермента из Sipunculus nudus , который является простым, недорогим и эффективным.
Abstract
Фибринолитический фермент из Sipunculus nudus (sFE) является новым фибринолитическим агентом, который может как активировать плазминоген в плазмин, так и напрямую расщеплять фибрин, демонстрируя большие преимущества по сравнению с традиционными тромболитическими агентами. Однако из-за недостатка структурной информации все программы очистки sFE основаны на многоступенчатых хроматографических очистках, которые являются слишком сложными и дорогостоящими. Здесь впервые разработан протокол аффинной очистки sFE на основе кристаллической структуры sFE; он включает в себя подготовку сырого образца и колонки аффинной хроматографии лизина/аргинин-агарозной матрицы, аффинную очистку и характеристику очищенного sFE. Следуя этому протоколу, партия sFE может быть очищена в течение 1 дня. Кроме того, чистота и активность очищенного sFE увеличивается до 92% и 19 200 Ед/мл соответственно. Таким образом, это простой, недорогой и эффективный подход к очистке sFE. Разработка этого протокола имеет большое значение для дальнейшего использования sFE и других подобных агентов.
Introduction
Тромбоз представляет собой серьезную угрозу для здоровья населения, особенно после глобальной пандемии Covid-19 1,2. Клинически многие активаторы плазминогена (ПА), такие как активатор плазминогена тканевого типа (tPA) и урокиназа (Великобритания), широко используются в качестве тромболитических препаратов. ПА могут активировать плазминоген пациентов в активный плазмин для расщепления фибрина. Таким образом, их тромболитическая эффективность сильно ограничена плазминогенным статусом пациентов 3,4. Фибринолитические агенты, такие как металлопротеиназная плазмина и сериновый плазмин, являются еще одним типом клинических тромболитических препаратов, которые также включают фибринолитические ферменты (ФЭ), такие как плазмин, которые могут растворять сгустки напрямую, но быстро инактивируются различными ингибиторами плазмина5. Впоследствии сообщалось о новом типе фибринолитического агента, который может растворять тромб, не только активируя плазминоген в плазмин, но и разлагая непосредственно фибрин 6-фибринолитический фермент древнего арахисового червя Sipunculus nudus (sFE)6. Эта бифункция наделяет sFE другими преимуществами по сравнению с традиционными тромболитическими препаратами, особенно с точки зрения аномального статуса плазминогена. По сравнению с другими бифункциональными фибринолитическими агентами 7,8,9, sFE демонстрирует ряд преимуществ, включая безопасность, по сравнению с непищевыми агентами для разработки лекарств, особенно для пероральных препаратов. Это связано с тем, что биобезопасность и биосовместимость Sipunculus nudus хорошо известны10.
Подобно другим природным фибринолитическим агентам, выделенным из микроорганизмов, дождевых червей и грибов, очистка sFE от S. nudus очень сложна и включает в себя несколько этапов, таких как гомогенизация тканей, осаждение сульфата аммония, опреснение, анионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и молекулярное просеивание10,11,12. Такая система очистки не только зависит от профессиональных навыков и дорогостоящих материалов, но и требует нескольких дней для завершения всей процедуры. Поэтому простая программа очистки sFE имеет большое значение для дальнейшего развития sFE. К счастью, два кристалла sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) были успешно получены (см. Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2). Благодаря структурному анализу и экспериментам по молекулярному стыковочному соединению мы обнаружили, что каталитическое ядро sFE может специфически связываться с мишенями, содержащими остатки аргинина или лизина.
Здесь впервые предложена система аффинной очистки, основанная на кристаллической структуре sFE. Следуя этому протоколу, высокочистый и высокоактивный sFE может быть очищен от сырых экстрактов на одной стадии аффинной очистки. Разработанный здесь протокол важен не только для крупномасштабного приготовления sFE, но также может быть применен для очистки других фибринолитических агентов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Из-за отсутствия точной последовательности генов sFE используемый в настоящее время sFE был извлечен из свежего S. nudus14. Кроме того, процедуры очистки sFE, описанные в литературе, были сложными и дорогостоящими, поскольку они основывались на некоторых общих характеристиках…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Научно-техническим бюро города Сямынь (3502Z20227197) и Научно-техническим бюро провинции Фуцзянь (No 2019J01070, No 2021Y0027).
Materials
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
- von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
- Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
- Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
- Ge, Y. -. H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
- Choi, J. -. H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -. J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
- Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
- Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
- . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019)
- Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
- Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
- Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
- Wiman, B. Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin. The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).
- Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
- Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
- Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
- Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).
