Sipunculus nudus'tan Bir Fibrinolitik Enzimin Afinite Saflaştırılması
Summary
Burada, Sipunculus nudus’tan fibrinolitik bir enzimin basit, ucuz ve verimli bir afinite saflaştırma yöntemi sunuyoruz.
Abstract
Sipunculus nudus’un (sFE) fibrinolitik enzimi, hem plazminojeni plazmine aktive edebilen hem de fibrini doğrudan parçalayabilen, geleneksel trombolitik ajanlara göre büyük avantajlar gösteren yeni bir fibrinolitik ajandır. Bununla birlikte, yapısal bilgi eksikliği nedeniyle, sFE için tüm saflaştırma programları, çok karmaşık ve maliyetli olan çok adımlı kromatografi saflaştırmalarına dayanmaktadır. Burada, sFE’nin kristal yapısına dayanan ilk kez sFE’nin bir afinite saflaştırma protokolü geliştirilmiştir; ham numunenin hazırlanmasını ve lizin/arginin-agaroz matrisi afinite kromatografisi kolonunu, afinite saflaştırmasını ve saflaştırılmış sFE’nin karakterizasyonunu içerir. Bu protokolü takiben, bir grup sFE 1 gün içinde saflaştırılabilir. Ayrıca, saflaştırılmış sFE’nin saflığı ve aktivitesi sırasıyla% 92 ve 19.200 U / mL’ye yükselir. Bu nedenle, bu sFE saflaştırması için basit, ucuz ve verimli bir yaklaşımdır. Bu protokolün geliştirilmesi, sFE ve diğer benzer ajanların daha fazla kullanımı için büyük önem taşımaktadır.
Introduction
Tromboz, özellikle Covid-19 küresel pandemisi 1,2 sonrasında halk sağlığı için büyük bir tehdittir. Klinik olarak, doku tipi plazminojen aktivatörü (tPA) ve ürokinaz (İngiltere) gibi birçok plazminojen aktivatörü (PA), trombolitik ilaçlar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. PA’lar, fibrini bozmak için hastaların plazminojenini aktif plazmine aktive edebilir. Bu nedenle, trombolitik verimlilikleri hastaların plazminojen durumu 3,4 ile büyük ölçüde kısıtlanmaktadır. Metalloproteinaz plazmin ve serin plazmin gibi fibrinolitik ajanlar, pıhtıları doğrudan çözebilen ancak çeşitli plazmin inhibitörleri tarafından hızla inaktive edilen plazmin gibi fibrinolitik enzimleri (FE) de içeren başka bir klinik trombolitik ilaç türüdür5. Daha sonra, sadece plazminojeni plazmine aktive etmekle kalmayıp, aynı zamanda eski fıstık solucanı Sipunculus nudus’tan (sFE) 6 fibrinolitik enzim olan fibrinidoğrudan parçalayarak trombüsü çözebilen yeni bir fibrinolitik ajan türü bildirilmiştir. Bu çift fonksiyonlu sFE’ye geleneksel trombolitik ilaçlara göre, özellikle anormal plazminojen durumu açısından başka avantajlar sağlar. Diğer iki fonksiyonlu fibrinolitik ajanlarla karşılaştırıldığında 7,8,9, sFE, özellikle oral ilaçlar için, ilaç geliştirme için gıda dışı türetilmiş ajanlara göre güvenlik de dahil olmak üzere çeşitli avantajlar göstermektedir. Bunun nedeni, Sipunculus nudus’un biyogüvenliği ve biyouyumluluğunun iyi kurulmuş olmasıdır10.
Mikroorganizmalardan, solucanlardan ve mantarlardan izole edilen diğer doğal fibrinolitik ajanlara benzer şekilde, sFE’nin S. nudus’tan saflaştırılması çok karmaşıktır ve doku homojenizasyonu, amonyum sülfat çökeltmesi, tuzdan arındırma, anyon değişim kromatografisi, hidrofobik etkileşim kromatografisi ve moleküler eleme gibi çoklu aşamaları içerir10,11,12. Böyle bir saflaştırma sistemi sadece yetkin becerilere ve pahalı malzemelere bağlı değildir, aynı zamanda tüm prosedürü tamamlamak için birkaç gün gerektirir. Bu nedenle, sFE’nin basit bir saflaştırma programı, sFE’nin daha da geliştirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Neyse ki, iki kristal sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) başarıyla elde edilmiştir (bkz. Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2). Yapısal analiz ve moleküler yerleştirme deneyleri sayesinde, sFE’nin katalitik çekirdeğinin özellikle arginin veya lizin kalıntıları içeren hedeflere bağlanabileceğini bulduk.
Burada, sFE’nin kristal yapısına dayanan ilk kez bir afinite arıtma sistemi önerilmiştir. Bu protokolü izleyerek, son derece saf ve oldukça aktif sFE, tek bir afinite saflaştırma aşamasında ham ekstraktlardan saflaştırılabilir. Burada geliştirilen protokol sadece sFE’nin büyük ölçekli hazırlanması için önemli değildir, aynı zamanda diğer fibrinolitik ajanların saflaştırılması için de uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
sFE’nin tam gen dizisinin bulunamaması nedeniyle, şu anda kullanılan sFE, taze S. nudus14’ten ekstrakte edildi. Ayrıca, literatürde bildirilen sFE’nin saflaştırma prosedürleri, moleküler ağırlık, izoelektrik nokta, iyonik mukavemet ve polarite15,16 gibi sFE’nin bazı genel özelliklerine dayandığı için karmaşık ve maliyetliydi. Bugüne kadar sFE’nin afinite saflaştırma protokolü bildirilmemiştir. Bu çalışm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Xiamen Şehri Bilim ve Teknoloji Bürosu (3502Z20227197) ve Fujian Eyaleti Bilim ve Teknoloji Bürosu (No. 2019J01070, No.2021Y0027) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
- von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
- Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
- Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
- Ge, Y. -. H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
- Choi, J. -. H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -. J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
- Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
- Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
- . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019)
- Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
- Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
- Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
- Wiman, B. Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin. The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).
- Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
- Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
- Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
- Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).
