De novo lipiden traceren met behulp van stabiele isotopenetikettering LC-TIMS-TOF MS/MS

Bij het analyseren van lipidegegevens is stabiele isotopenetikettering (SIL) een effectieve methode om metabole routes in levende organismen te beoordelen. Bij deze methode worden atomen in een analyt vervangen door stabiele isotopen die ¹³C of ²H bevatten. Deze isotopen worden verder opgenomen in voorlopers, die later worden ingebed in de vetzuren en de gebieden waarin ze zich bevinden labelen. Met deze isotopen is men in staat om de distributie en het metabolisme van lipiden te identificeren, omdat ze contrasteren met de niet-gelabelde achtergrond¹. Gewone massaspectrometrieplatforms zijn niet in staat om het signaal te onderscheiden dat afkomstig is van endogene moleculen². Het succes van SIL vereist het gebruik van analytische tools met ultrahoge resolutie. Vloeistofchromatografie gekoppeld aan hoge-resolutie ingesloten ionenmobiliteit spectrometrie-parallelle accumulatie, sequentiële fragmentatie-time-of-flight, tandem massaspectrometrie (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) maakt de scheiding mogelijk van gelabelde en niet-gelabelde soorten². Het voordeel van LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS-analyse is dat het MS-signaal kan worden gefilterd op basis van de retentietijd (RT) en mobiliteit, waardoor mogelijke interferenties van endogene moleculen worden verminderd, evenals kwantificering en scheiding van alle gewenste species². Bij TIMS wordt een ion eerst stationair gehouden tegen een gasmobiele fase en vervolgens vrijgegeven op basis van zijn mobiliteit. Dit zorgt voor mobilogrammen met een hoge resolutie terwijl ze op een lagere spanning werken dan eerdere IMS-instrumentatie³. Mobilogrammen zijn grafieken van massa tot lading versus drifttijd die kunnen worden gebruikt om onderscheid te maken tussen verbindingen op basis van hun drifttijd en de mate van overlap⁴.

Door gebruik te maken van een extra PASEF-techniek wordt de sequencingsnelheid sterk verhoogd zonder dat dit ten koste gaat van de gevoeligheid⁵. De PASEF-theorie gaat uit van de accumulatie van ionen, gevolgd door hun opeenvolgende afgifte in de volgorde van hun mobiliteit. Dit wordt gedaan door ionen te accumuleren in parallelle uitlijning met hun mobiliteit. De accumulatie op deze manier voorkomt ionenverlies. Bovendien vindt de selectie van de voorloperionen gelijktijdig plaats met de accumulatie en afgifte van de ionen. Met deze methode selecteert PASEF tijdens elke TIMS-scan meerdere voorlopers in serie, in plaats van de individuele voorlopers per scan die typisch zijn voor een TIMS-instrument dat geen PASEF gebruikt. Wanneer de voorloperionen gelijktijdig worden geaccumuleerd en vrijgegeven in pieken van 2 ms binnen een TIMS-scan van ongeveer 100 ms per frame, wordt het signaal met meer dan één orde van grootte versterkt, waardoor de signaal-ruisverhouding³ toeneemt. De PASEF-toevoeging aan het TIMS verhoogt de efficiëntie van de MS/MS. Omdat de TIMS-PASEF gekoppeld is aan MS/MS, is een efficiëntere fragmentatie mogelijk. In tegenstelling tot conventionele MS/MS-detectie, wordt het voorlopersignaal gecomprimeerd van de TIMS-PASEF en worden de fragmentionen tegelijkertijd gedetecteerd naar de TIMS-elutietijd en ionenmobiliteitspositie van de voorloper³.

Bij het verkrijgen van gegevens van een massaspectrometer zijn er opties in de gewenste scanmodus. Data-afhankelijke acquisitie (DDA) selecteert voorloperionen uit de MS1-scan op basis van hun overvloed, voordat ze worden gefragmenteerd en de MS2-scan wordt uitgevoerd. Deze scanmodus fragmenteert zoveel mogelijk voorlopers. De DDA-aanpak is doelgericht en de resultaten zullen afhangen van de ionenselectie³. DDA-PASEF heeft echter vaak problemen met de reproduceerbaarheid tussen replicaten. Hoewel DDA een geweldig hulpmiddel is in een gerichte analyse, hebben complexe mengsels meer moeite met het verzamelen van gegevens⁶. Dit komt omdat slechts een kleine hoeveelheid ionen tegelijkertijd kan worden gecontroleerd³. Gegevensonafhankelijke acquisitie (DIA) is een methode waarbij vooraf geselecteerde vensters van m/z onafhankelijk van hun intensiteit worden gefragmenteerd en allemaal worden gescand binnen het bereik⁷. Met deze scanmodus worden volledige ionenwolken verzonden van het IMS naar de massaspectrometer³. In proteomics-studies leidt dit ertoe dat grotere hoeveelheden eiwitten in een kortere tijdspanne worden gekwantificeerd in vergelijking met DDA. Daarnaast mist DIA minder m/z waarden in vergelijking met DDA. Daarom heeft dit alternatief grote verbeteringen laten zien in de reproduceerbaarheid van gegevens in signaal-ruisverhouding en een betere kwantificering dan DDA. In dit huidige werk is ons doel om DIA te implementeren volgens de methode gerapporteerd door Tose et ^al.2. We verbeterden de reproduceerbaarheid en intensiteit van signalen, wat meer en meer overtuigende informatie opleverde over de mobilisatie, distributie en het metabolisme van SIL-lipiden in biologische monsters door gebruik te maken van DDA- en DIA-acquisitie.