מעקב אחר ליפידים של נובו באמצעות תיוג איזוטופ יציב LC-TIMS-TOF MS/MS
Summary
מוצגת כאן שיטה לסינון מבני שומנים באמצעות תיוג איזוטופים יציבים באמצעות זמן השמירה, הניידות והפיצול שלהם.
Abstract
שומנים הם מגוונים מאוד, ושינויים קטנים במבנה השומנים ובהרכבם יכולים להיות בעלי השפעות עמוקות על תפקודים ביולוגיים קריטיים. תיוג איזוטופים יציבים (SIL) מציע מספר יתרונות לחקר פיזור השומנים, ניודיזציה ומטבוליזם, כמו גם סינתזת שומנים דה נובו . היישום המוצלח של טכניקת SIL דורש הסרת הפרעות ממולקולות אנדוגניות. בעבודה הנוכחית אנו מתארים פרוטוקול אנליטי בתפוקה גבוהה לבדיקת שומנים SIL מדגימות ביולוגיות; יוצגו דוגמאות לזיהוי שומנים דה נובו במהלך התפתחות שחלות יתושים. השימוש בכרומטוגרפיה נוזלית משלימה, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה מאפשר הפרדה והקצאת שומנים מדגימה בודדת בסריקה אחת (<1 שעות). הגישה המתוארת מנצלת את ההתפתחויות האחרונות ברכישה תלוית נתונים ורכישה בלתי תלויה בנתונים, תוך שימוש בצבירה מקבילית במלכודת הניידות ואחריה פיצול רציף ודיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות. מדידת SIL ברמת שרשרת חומצות השומן מגלה שינויים בדינמיקה של שומנים במהלך התפתחות השחלה של יתושים. מבני השומנים דה נובו מוקצים בביטחון בהתבסס על זמן השמירה שלהם, ניידות ודפוס הפיצול שלהם.
Introduction
בעת ניתוח נתוני שומנים, תיוג איזוטופים יציבים (SIL) הוא שיטה יעילה להערכת מסלולים מטבוליים באורגניזמים חיים. בשיטה זו, אטומים בתוך אנליט מוחלפים על ידי איזוטופים יציבים המכילים 13C או 2H. איזוטופים אלה משולבים עוד יותר בקודמנים, אשר מוטמעים מאוחר יותר בתוך חומצות השומן, ומסמנים את האזורים שבהם הם שוכנים. עם איזוטופים אלה, ניתן לזהות את התפלגות ומטבוליזם של שומנים, כפי שהם יהיו בניגוד לרקע ללא תווית1. פלטפורמות ספקטרומטריית מסות נפוצות אינן מסוגלות להבחין בין האות המגיע ממולקולות אנדוגניות2. ההצלחה של SIL דורשת שימוש בכלים אנליטיים ברזולוציה גבוהה במיוחד. כרומטוגרפיה נוזלית המצומדת לספקטרומטריית ניידות יונים לכודים ברזולוציה גבוהה-צבירה מקבילית, ספקטרומטריית מסה טנדם רציפה של פיצול רציף-זמן-טיסה (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) מאפשרת הפרדה בין מינים מסומנים ללא מסומנים2. היתרון של ניתוח LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS הוא שניתן לסנן את אות הטרשת הנפוצה לפי זמן השמירה (RT) והניידות, ובכך להפחית הפרעות פוטנציאליות של מולקולות אנדוגניות, כמו גם כימות והפרדה של כל המינים הרצויים2. ב-TIMS, יון מוחזק תחילה במצב נייח כנגד פאזה ניידת גז ולאחר מכן משוחרר בהתאם לניידות שלו. זה מספק ניידות ברזולוציה גבוהה תוך פעולה במתח נמוך יותר מאשר מכשור IMS מוקדם יותר3. מובילוגרמות הן חלקות של מסה לטעינה לעומת זמן סחף שניתן להשתמש בהן כדי להבחין בין תרכובות בהתבסס על זמן הסחף שלהן וכמות החפיפה שלהן4.
על ידי שימוש בטכניקת PASEF נוספת, מהירות הרצף גדלה מאוד מבלי להקריב את רגישות5. תאוריית PASEF כוללת הצטברות של יונים ואחריה שחרורם הרציף לפי סדר ניידותם. זה נעשה על ידי צבירת יונים ביישור מקביל לניידות שלהם. ההצטברות באופן זה מונעת אובדן יונים. יתר על כן, בחירת היונים המקדימים מתרחשת בו זמנית עם הצטברות ושחרור היונים. בשיטה זו, PASEF בוחר מבשרי סדרה מרובים במהלך כל סריקת TIMS, במקום קודמנים בודדים לכל סריקה האופייניים למכשיר TIMS שאינו משתמש ב- PASEF. כאשר היונים המקדימים מצטברים בו זמנית ומשוחררים בפסגות של 2 אלפיות השנייה בסריקת TIMS של כ-100 מילישניות לפריים, האות מוגבר ביותר מסדר גודל אחד, ובכך מגדיל את יחס האות לרעש3. תוספת PASEF ל- TIMS מגבירה את היעילות של MS/MS. מכיוון ש-TIMS-PASEF משולב עם MS/MS, פיצול יעיל יותר אפשרי. שלא כמו זיהוי MS/MS קונבנציונלי, האות המקדים נדחס מה-TIMS-PASEF, ויוני השבר מזוהים בו זמנית לזמן האלוציה של TIMS ולמיקום ניידות היונים של קודמן3.
בעת רכישת נתונים מספקטרומטר מסות, ישנן אפשרויות במצב הסריקה הרצוי. רכישה תלוית נתונים (DDA) בוחרת יונים מקדימים מסריקת MS1 בהתבסס על השפע שלהם, לפני פיצול שלהם וביצוע סריקת MS2. מצב סריקה זה מקטעים כמה שיותר סימנים מקדימים. גישת DDA ממוקדת, והתוצאות יהיו תלויות בבחירת היונים3. עם זאת, DDA-PASEF לעתים קרובות יש בעיות ביכולת השחזור בין משכפלים. בעוד DDA הוא כלי נהדר בניתוח ממוקד, תערובות מורכבות יש קושי גדול יותר ברכישת הנתונים שלהם6. הסיבה לכך היא שרק כמות קטנה של יונים ניתן לנטר בו זמנית3. רכישה עצמאית של נתונים (DIA) היא שיטה שבה חלונות m/z שנבחרו מראש מפוצלים בנפרד מעוצמתם, וכולם נסרקים בטווח7. במצב סריקה זה, ענני יונים שלמים משודרים מה-IMS לספקטרומטר המסות3. במחקרי פרוטאומיקה התוצאה היא שכמויות גדולות יותר של חלבונים מכומתות בטווח זמן קצר יותר בהשוואה ל-DDA. בנוסף, DIA מחמיץ פחות ערכי m/z בהשוואה ל- DDA. לכן, חלופה זו הראתה שיפורים גדולים ביכולת שחזור הנתונים ביחס אות לרעש וכימות טוב יותר מאשר DDA. בעבודה הנוכחית מטרתנו היא ליישם DIA בשיטה שדווחה על ידי Tose et al.2. שיפרנו את יכולת השחזור והעוצמה של אותות, והפקנו מידע נוסף וחד משמעי יותר על ניוד, הפצה ומטבוליזם של שומנים ב-SIL בדגימות ביולוגיות תוך ניצול רכישת DDA ו-DIA.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעת הערכת השימוש בפרוטוקול זה, חיוני לוודא שהפרמטרים DIA-PASEF ו- MS/MS ישימים לטריגליצרידים המדוברים. באופן ספציפי, חלונות ניידות רוחב החלון צריך לעקוב אחר דפוס של טריגליצרידים. ניתן לקבוע זאת באמצעות הפעלה קודמת בשיטת DDA. בעת מעקב אחר הטריגליצרידים בתקן הפנימי, החלונות להגדרת DIA צריכים לכסות את…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים אוהבים להכיר בתרומתו של ד”ר סזאר רמירז במהלך פיתוחי השיטה הראשוניים. מחקר זה מומן על ידי מענקי NIAID R21AI167849 FGN, פרויקט 22-21244S מקרן המדע הצ’כית, צ’כיה למינסוטה.
Materials
| Accucore C30 colum | Thermo Fisher Scientific | 27826-252130 | |
| Bruker Compass Data Analysis | Bruker Daltonics Inc | 2363525870 | Version 5.2 |
| d-Glucose-13C6 | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | |
| EquiSplash Lipidomix | Avanti Polar Lipids | 330731-1EA | |
| glass vials | Thermo Fisher Scientific | 11-417-236 | |
| heavy water (2H2O) | Sigma-Aldrich | 1.13366 | |
| polypropylene pestles | Fisher Scientific | BAF199230001 | |
| Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph | Shimadzu | L20234651907 | |
| silanized glass inserts | Thermo Fisher Scientific | 03-251-826 | |
| Sucrose-13C12 | Sigma-Aldrich | 605417 | |
| timsTOF | Bruker Daltonics Inc | 1.84443E+11 | |
| Tuning Mix Calibration Standard | Agilent Technologies | 36 |
References
- Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).
- Tose, L. V., et al. Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies. Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).
- Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138 (2021).
- Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics. Metabolomics. 12 (3), 50 (2016).
- Meier, F., et al. Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
- Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA. Proteomics. 18 (1), 1700304 (2018).
- Fernández-Costa, C., et al. Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results. J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).
- Prakash, A., et al. Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis. J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).
- Tsou, C. C., et al. DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).
- Triebl, A., Wenk, M. R. Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics. Biomolecules. 8 (4), 151 (2018).
