Rastreamento de lipídios de novo usando marcação de isótopos estáveis LC-TIMS-TOF MS/MS

Ao analisar dados lipídicos, a marcação de isótopos estáveis (SIL) é um método eficaz para avaliar as vias metabólicas em organismos vivos. Neste método, os átomos dentro de um analito são substituídos por isótopos estáveis contendo ¹³C ou ²H. Esses isótopos são posteriormente incorporados aos precursores, que são posteriormente incorporados aos ácidos graxos, rotulando as áreas em que residem. Com esses isótopos, é possível identificar a distribuição e o metabolismo dos lipídios, pois eles contrastarão com o fundo não rotulado¹. As plataformas comuns de espectrometria de massa não são capazes de distinguir o sinal proveniente de moléculas endógenas². O sucesso do SIL requer o uso de ferramentas analíticas de ultra-alta resolução. A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de mobilidade iônica aprisionada de alta resolução – espectrometria de massa sequencial de fragmentação sequencial de acumulação sequencial – tempo de voo (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS / MS) permite a separação de espécies marcadas e não marcadas². A vantagem da análise LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS é que o sinal MS pode ser filtrado pelo tempo de retenção (RT) e mobilidade, reduzindo assim potenciais interferências de moléculas endógenas, bem como quantificação e separação de todas as espécies desejadas². No TIMS, um íon é primeiro mantido estacionário contra uma fase gás-móvel e posteriormente liberado de acordo com sua mobilidade. Isso fornece alta resolução Mobilogramas são gráficos de massa a carregar versus tempo de deriva que podem ser usados para distinguir entre compostos com base em seu tempo de deriva e quantidade de sobreposição⁴.

Usando uma técnica PASEF adicional, a velocidade de sequenciamento é bastante aumentada sem sacrificar a sensibilidade⁵. A teoria PASEF envolve o acúmulo de íons seguido por sua liberação sequencial na ordem de sua mobilidade. Isso é feito acumulando íons em alinhamento paralelo à sua mobilidade. O acúmulo dessa maneira evita a perda de íons. Além disso, a seleção do íon precursor ocorre simultaneamente com o acúmulo e a liberação dos íons. Com este método, o PASEF seleciona vários precursores em série durante cada varredura TIMS, em vez dos precursores individuais por varredura típicos de um instrumento TIMS que não usa PASEF. Quando os íons precursores são acumulados e liberados simultaneamente em picos de 2 ms em uma varredura TIMS de aproximadamente 100 ms por quadro, o sinal é amplificado em mais de uma ordem de magnitude, aumentando assim a relação sinal-ruído³. A adição do PASEF ao TIMS aumenta a eficiência do MS/MS. Como o TIMS-PASEF é acoplado ao MS/MS, é possível uma fragmentação mais eficiente. Ao contrário da detecção convencional de MS/MS, o sinal precursor é comprimido a partir do TIMS-PASEF e os íons fragmentos são detectados simultaneamente ao tempo de eluição do TIMS e à posição de mobilidade iônica do precursor³.

Ao adquirir dados de um espectrômetro de massa, existem opções no modo de varredura desejado. A aquisição dependente de dados (DDA) seleciona íons precursores da varredura MS1 com base em suas abundâncias, antes de fragmentá-los e realizar a varredura MS2. Este modo de varredura fragmenta o maior número possível de precursores. A abordagem DDA é direcionada e os resultados dependerão da seleção de íons³. No entanto, o DDA-PASEF frequentemente apresenta problemas na reprodutibilidade entre as repetições. Embora a DDA seja uma ótima ferramenta em uma análise focada, misturas complexas têm maior dificuldade em sua aquisição de dados⁶. Isso ocorre porque apenas uma pequena quantidade de íons pode ser monitorada simultaneamente³. A aquisição independente de dados (DIA) é um método em que as janelas pré-selecionadas de m/z são fragmentadas independentemente de sua intensidade e todas são verificadas dentro do intervalo⁷. Com este modo de varredura, nuvens de íons inteiras são transmitidas do IMS para o espectrômetro de massa³. Em estudos proteômicos, isso resulta em maiores quantidades de proteínas sendo quantificadas em um período de tempo mais curto em comparação com o DDA. Além disso, o DIA perde menos valores de m/z em comparação com o DDA. Portanto, esta alternativa mostrou grandes melhorias na reprodutibilidade dos dados na relação sinal-ruído e melhor quantificação do que o DDA. No presente trabalho, nosso objetivo é implementar a DIA ao método relatado por Tose et ^al.2. Melhoramos a reprodutibilidade e a intensidade dos sinais, produzindo informações adicionais e mais conclusivas sobre a mobilização, distribuição e metabolismo de lipídios SIL em amostras biológicas aproveitando a aquisição de DDA e DIA.