Kararlı İzotop Etiketleme LC-TIMS-TOF MS/MS kullanarak de novo Lipidlerin İzlenmesi
Summary
Burada sunulan, alıkonma sürelerini, hareketliliklerini ve parçalanmalarını kullanarak kararlı izotop etiketleme yoluyla lipid yapılarını taramak için bir yöntemdir.
Abstract
Lipitler oldukça çeşitlidir ve lipit yapılarındaki ve bileşimindeki küçük değişikliklerin kritik biyolojik işlevler üzerinde derin etkileri olabilir. Kararlı izotop etiketleme (SIL), lipid dağılımı, mobilizasyonu ve metabolizmasının yanı sıra de novo lipid sentezi çalışmaları için çeşitli avantajlar sunar. SIL tekniğinin başarılı bir şekilde uygulanması, endojen moleküllerden kaynaklanan girişimlerin giderilmesini gerektirir. Bu çalışmada, biyolojik örneklerden SIL lipidlerinin taranması için yüksek verimli bir analitik protokol tanımlanmıştır; Sivrisinek yumurtalık gelişimi sırasında lipid de novo tanımlama örnekleri gösterilecektir. Tamamlayıcı sıvı kromatografisi tuzaklı iyon hareketlilik spektrometrisi ve kütle spektrometresinin kullanılması, tek bir numuneden tek bir taramada (<1 saat) ayırma ve lipit atamasına izin verir. Açıklanan yaklaşım, hareketlilik tuzağında paralel birikimi ve ardından sıralı parçalanma ve çarpışma kaynaklı ayrışmayı kullanarak, veriye bağımlı edinim ve veriden bağımsız edinimdeki son gelişmelerden yararlanır. Yağ asidi zinciri düzeyinde SIL ölçümü, sivrisineklerin yumurtalık gelişimi sırasında lipit dinamiklerindeki değişiklikleri ortaya koymaktadır. Lipitler de novo yapıları, tutma sürelerine, hareketliliklerine ve parçalanma modellerine göre güvenle atanır.
Introduction
Lipid verilerini analiz ederken, kararlı izotop etiketleme (SIL), canlı organizmalardaki metabolik yolları değerlendirmek için etkili bir yöntemdir. Bu yöntemde, bir analit içindeki atomlar, 13C veya 2H içeren kararlı izotoplarla değiştirilir. Bu izotoplar ayrıca, daha sonra yağ asitlerinin içine gömülen ve bulundukları alanları etiketleyen öncülere dahil edilir. Bu izotoplarla, etiketlenmemiş arka plan1 ile kontrast oluşturacakları için lipitlerin dağılımını ve metabolizmasını tanımlayabilirsiniz. Ortak kütle spektrometresi platformları, endojen moleküllerden gelen sinyali ayırt edemez2. SIL’in başarısı, ultra yüksek çözünürlüklü analitik araçların kullanılmasını gerektirir. Yüksek çözünürlüklü tuzaklanmış iyon hareketlilik spektrometrisi-paralel birikim sıralı parçalanma-uçuş zamanı tandem kütle spektrometrisi (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) ile birleştirilmiş sıvı kromatografisi, etiketli ve etiketsiz türlerin ayrılmasına izin verir2. LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS analizinin avantajı, MS sinyalinin alıkonma süresi (RT) ve hareketlilik ile filtrelenebilmesi, böylece endojen moleküllerin potansiyel girişimlerinin azaltılmasının yanı sıra istenen tüm türlerin nicelleştirilmesi ve ayrılmasıdır2. TIMS’de, bir iyon önce bir gaz-mobil faza karşı sabit tutulur ve daha sonra hareketliliğine göre serbest bırakılır. Bu, önceki IMS enstrümantasyonundan daha düşük bir voltajda çalışırken yüksek çözünürlüklü mobilogramlar sağlar3. Mobilogramlar, sürüklenme sürelerine ve örtüşme miktarına göre bileşikleri ayırt etmek için kullanılabilen, sürüklenme süresine karşı yüklenecek kütle grafikleridir4.
Ek bir PASEF tekniği kullanılarak, hassasiyetten ödün vermeden dizileme hızı büyük ölçüde artırılır5. PASEF teorisi, iyonların birikimini ve ardından hareketlilik sırasına göre sıralı salınımlarını içerir. Bu, iyonların hareketliliklerine paralel hizada birikmesiyle yapılır. Bu şekilde birikme iyon kaybını önler. Ayrıca, öncü iyon seçimi, iyonların birikmesi ve salınması ile eş zamanlı olarak gerçekleşir. Bu yöntemle PASEF, PASEF kullanmayan bir TIMS cihazının tipik özelliği olan tarama başına tek tek öncüler yerine, her TIMS taraması sırasında seri olarak birden fazla öncül seçer. Öncü iyonlar, çerçeve başına yaklaşık 2 ms’lik bir TIMS taraması içinde 100 ms’lik zirvelerde eşzamanlı olarak biriktirildiğinde ve serbest bırakıldığında, sinyal bir büyüklük sırasının üzerinde yükseltilir, bu nedenle sinyal-gürültü oranı3 artar. TIMS’e PASEF ilavesi, MS/MS’nin verimliliğini artırır. TIMS-PASEF, MS/MS ile birleştirildiği için daha verimli bir parçalanma mümkündür. Konvansiyonel MS/MS tespitinden farklı olarak, öncü sinyal TIMS-PASEF’ten sıkıştırılır ve parça iyonları, öncü3’ün TIMS elüsyon süresi ve iyon hareketliliği konumu ile aynı anda tespit edilir.
Bir kütle spektrometresinden veri alırken, istenen tarama modunda seçenekler vardır. Veriye bağlı edinim (DDA), MS1 taramasından öncü iyonları parçalamadan ve MS2 taramasını gerçekleştirmeden önce bolluklarına göre seçer. Bu tarama modu, mümkün olduğu kadar çok öncüyü parçalar. DDA yaklaşımı hedeflenmiştir ve sonuçlar iyon seçiminebağlı olacaktır 3. Bununla birlikte, DDA-PASEF genellikle replikasyonlar arasındaki tekrarlanabilirlik konusunda problemler yaşar. DDA, odaklanmış bir analizde harika bir araç olsa da, karmaşık karışımlar veri toplamada daha fazla zorluk çeker6. Bunun nedeni, aynı anda yalnızca küçük bir miktarda iyonun izlenebilmesidir3. Veriden bağımsız edinim (DIA), önceden seçilmiş m/z pencerelerinin yoğunluklarından bağımsız olarak parçalandığı ve tümünün7 aralığında tarandığı bir yöntemdir. Bu tarama modu ile, tüm iyon bulutları IMS’den kütle spektrometresi3’e iletilir. Proteomik çalışmalarda bu, DDA’ya kıyasla daha kısa bir zaman diliminde daha fazla miktarda proteinin ölçülmesine neden olur. Ek olarak, DIA, DDA’ya kıyasla daha az m/z değerini kaçırır. Bu nedenle, bu alternatif, sinyal-gürültü oranında veri tekrarlanabilirliğinde büyük gelişmeler ve DDA’dan daha iyi niceleme göstermiştir. Bu çalışmada amacımız, Tose ve ark.2 tarafından bildirilen yönteme DİA uygulamaktır. DDA ve DIA ediniminden yararlanarak biyolojik örneklerde SIL lipidlerinin mobilizasyonu, dağılımı ve metabolizması hakkında daha fazla ve daha kesin bilgi sağlayarak sinyallerin tekrarlanabilirliğini ve yoğunluğunu iyileştirdik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolün kullanımını değerlendirirken, DIA-PASEF ve MS/MS parametrelerinin söz konusu trigliseritlere uygulanabilir olduğundan emin olmak önemlidir. Spesifik olarak, hareketlilik pencereleri ve pencere genişliği trigliseritlerin modelini takip etmelidir. Bu, DDA yöntemi kullanılarak önceki bir çalıştırma ile belirlenebilir. Dahili standartta trigliseritleri izlerken, DIA kurulumu için pencereler önceden tanımlanmış tüm ilgili molekülleri kapsamalıdır. Pencerelerin tümü eşit boyutlarda ol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, ilk yöntem geliştirmeleri sırasında Dr. Cesar Ramirez’in katkılarını kabul etmek isterler. Bu araştırma, FGN’ye R21AI167849 NIAID hibeleri, Çek Cumhuriyeti’ndeki Çek Bilim Vakfı’ndan MN’ye 22-21244S projesi tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Accucore C30 colum | Thermo Fisher Scientific | 27826-252130 | |
| Bruker Compass Data Analysis | Bruker Daltonics Inc | 2363525870 | Version 5.2 |
| d-Glucose-13C6 | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | |
| EquiSplash Lipidomix | Avanti Polar Lipids | 330731-1EA | |
| glass vials | Thermo Fisher Scientific | 11-417-236 | |
| heavy water (2H2O) | Sigma-Aldrich | 1.13366 | |
| polypropylene pestles | Fisher Scientific | BAF199230001 | |
| Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph | Shimadzu | L20234651907 | |
| silanized glass inserts | Thermo Fisher Scientific | 03-251-826 | |
| Sucrose-13C12 | Sigma-Aldrich | 605417 | |
| timsTOF | Bruker Daltonics Inc | 1.84443E+11 | |
| Tuning Mix Calibration Standard | Agilent Technologies | 36 |
References
- Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).
- Tose, L. V., et al. Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies. Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).
- Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138 (2021).
- Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics. Metabolomics. 12 (3), 50 (2016).
- Meier, F., et al. Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
- Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA. Proteomics. 18 (1), 1700304 (2018).
- Fernández-Costa, C., et al. Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results. J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).
- Prakash, A., et al. Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis. J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).
- Tsou, C. C., et al. DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).
- Triebl, A., Wenk, M. R. Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics. Biomolecules. 8 (4), 151 (2018).
