As doenças oculares degenerativas que afetam a camada do epitélio pigmentado da retina do olho têm origem monogênica e poligênica. Vários modelos de doença e um software, LipidUNet, foram desenvolvidos para estudar mecanismos de doença, bem como potenciais intervenções terapêuticas.
O epitélio pigmentado da retina (EPR) é uma monocamada de células hexagonais localizada na parte posterior do olho. Fornece nutrição e suporte a fotorreceptores e capilares coroidais, realiza fagocitose de segmentos externos (POS) fotorreceptores e secreta citocinas de forma polarizada para manter a homeostase da retina externa. A EPR disfuncional, causada por mutações, envelhecimento e fatores ambientais, resulta na degeneração de outras camadas da retina e causa perda da visão. Uma característica fenotípica marcante da degeneração do EPR são os depósitos ricos em lipídios intra e subcelulares. Esses depósitos são um fenótipo comum em diferentes doenças degenerativas da retina. Para reproduzir in vitro o fenótipo de depósito lipídico das degenerações retinianas monogênicas, o EPR derivado de células-tronco pluripotentes induzido (iRPE) foi gerado a partir de fibroblastos dos pacientes. Linhagens celulares geradas a partir de pacientes com doença de Stargardt e degeneração retiniana de início tardio (L-ORD) foram alimentadas com POS por 7 dias para replicar a função fisiológica do EPR, que causou patologia induzida por fagocitose POS nessas doenças. Para gerar um modelo para a degeneração macular relacionada à idade (DMRI), uma doença poligênica associada à ativação alternativa do complemento, a iRPE foi desafiada com anafilatoxinas alternativas do complemento. Os depósitos lipídicos intra e subcelulares foram caracterizados utilizando-se Vermelho do Nilo, boro-dipirrometeno (BODIPY) e apolipoproteína E (APOE). Para quantificar a densidade dos depósitos lipídicos, foi desenvolvido um software baseado em aprendizado de máquina, o LipidUNet. O software foi treinado em imagens de projeção de máxima intensidade de iRPE em superfícies de cultura. No futuro, será treinado para analisar imagens tridimensionais (3D) e quantificar o volume de gotículas lipídicas. O software LipidUNet será um recurso valioso para a descoberta de fármacos que diminuam o acúmulo lipídico em modelos de doenças.
O epitélio pigmentado da retina (EPR) é uma monocamada de células localizada na parte posterior do olho adjacente aos fotorreceptores da retina. O EPR desempenha um papel vital na manutenção da visão adequada, fornecendo suporte metabólico e estrutural aos fotorreceptores. As células saudáveis do EPR são caracterizadas por uma morfologia hexagonal distinta. Eles são conectados por tight junctions, que permitem que o PSE atue como uma barreira entre os coriocapilares localizados em sua face basal e os fotorreceptores localizados apicamente. Para manter o ecossistema da retina, o EPR transporta metabólitos-chave, por exemplo, glicose, para fotorreceptores de forma a minimizar o consumo de glicose no EPR1. Devido a essa limitação, o EPR depende de outros metabólitos para manter suas necessidades metabólicas, incluindo os ácidos graxos, que o EPR converte em cetonas por meio da β-oxidação2. Dada a propensão do EPR a utilizar ácidos graxos, que provavelmente são reciclados da digestão do segmento externo (SOP) dos fotorreceptores, como fonte de energia, alterações prejudiciais nas vias de processamento lipídico no EPR frequentemente levam ou estão implicadas em doenças degenerativas retinianas monogênicas e poligênicas3.
A degeneração macular relacionada à idade (DMRI), uma doença ocular degenerativa poligênica que causa degeneração do EPR, também tem sido associada à autofagia aberrante e ao metabolismo lipídico na monocamada do EPR. A falha de uma monocamada disfuncional de EPR em processar a SOP e executar outras funções críticas leva a depósitos extracelulares (sub-PSE) chamados depósitos lineares basais (BLinD) localizados entre o EPR e a membrana de Bruch – uma característica das patologias da DMRI. Os principais componentes da LBinD incluem as lipoproteínas, sendo a apolipoproteína E (APOE) a mais abundante4. O acúmulo de finas camadas de LBinD pode levar a drusas moles, o que é reconhecido como sintoma clínico da DMRI 5,6.
Vários grupos têm demonstrado que modelos de doenças in vitro derivadas de células-tronco que causam disfunção do EPR apresentam acúmulo lipídico sub-EPR 7,8,9. (2017) geraram EPR pluripotente induzido derivado de células-tronco (iRPE) de pacientes com alto risco de DMRI devido a um polimorfismo do gene CFH. A iPSE apresentou acúmulo de drusa, como marcado pela APOE, e a PSE de alto risco acumulou depósitos maiores do que a iRPE gerada em pacientes de baixo risco10.
Para criar um modelo in vitro que recapitule as características celulares da DMRI, como gotículas lipídicas e deposição de drusas, linhagens de iRPE geradas a partir de amostras de sangue de pacientes foram estabelecidas usando um protocolo guiado pelo desenvolvimento previamente publicado11. Os iRPE foram submetidos ao soro humano competente para o complemento (CC-HS), uma solução contendo anafilatoxinas que mimetizam uma possível causa de DMRI: aumento da sinalização alternativa do complemento8. A deposição celular e subcelular resultante dos depósitos lipídicos foi medida usando marcadores lipídicos e lipoprotéicos comumente usados, APOE, Nile Red e BODIPY. Por meio desses marcadores, demonstrou-se que a sinalização ativada do complemento via CC-HS exacerbou o acúmulo lipídico nas células iRPE8.
Para desenvolver um modelo de doença para uma doença degenerativa retiniana monogênica, linhagens de iRPE foram desenvolvidas a partir de pacientes com doença de Stargardt, uma doença causada por mutações no gene ABCA4 em EPR. Foi demonstrado anteriormente que, quando o ABCA4 é nocauteado, a lipofuscina A2E, um depósito intracelular conhecido por conter altos níveis de fosfolipídios e produtos de peroxidação lipídica dependentes de luz, se acumula dentro do EPR12. Linhagens knockout ABCA4 foram desenvolvidas ao lado das linhagens dos pacientes, e ambas foram submetidas à alimentação por PDV. O Stargardt iRPE demonstrou patologia induzida por fagocitose POS, exibindo aumento do acúmulo lipídico quantificado pela coloração BODIPY. PSE derivados de iPSCs ABCA4 KO foram submetidos ao tratamento CC-HS; a quantificação do sinal BODIPY também mostrou defeito no manuseio lipídico no modelo da doença de Stargardt9.
Dada a prevalência dessas doenças e a necessidade de terapêuticas eficazes, juntamente com os modelos de doenças relevantes descritos acima, há necessidade de estabelecer métodos robustos para quantificar a eficácia de potenciais tratamentos. Para quantificar os depósitos lipídicos de forma objetiva, automatizada e padronizada, um software baseado em aprendizado de máquina, LipidUNet, foi criado para que, quando emparelhado com ferramentas de análise de máscaras, a deposição lipídica possa ser rápida e efetivamente identificada usando os marcadores comuns Nile Red, BODIPY e APOE. As estatísticas resumidas obtidas usando este pipeline de análise podem então ser analisadas e exibidas graficamente, permitindo uma fácil comparação das condições de tratamento. O esquema do protocolo é mostrado na Figura 1.
Figura 1: Esquema do protocolo: As células do EPR são cultivadas em uma placa de 96 poços e desafiadas com soro humano ativo ou segmentos externos bovinos purificados para modelar diferentes tipos de degenerações retinianas in vitro. As células do EPR são fixadas e coradas para depósitos de lipoproteínas com Vermelho do Nilo, BODIPY e APOE. Um microscópio confocal é usado para adquirir pilhas Z de partículas lipídicas fluorescentemente marcadas, que são subsequentemente processadas em projeções de intensidade máxima 2D. Um algoritmo de aprendizado de máquina foi treinado para reconhecer e segmentar corretamente as partículas de lipoproteínas. Tabelas de resumo contendo contagem de partículas e várias métricas de forma são geradas e podem ser usadas para plotagem subsequente e análise estatística. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Este protocolo fornece um método para marcar, imagear e quantificar eficientemente depósitos lipídicos em modelos de doenças in vitro monogênicas e poligênicas para doenças oculares degenerativas. O software baseado em IA, LipidUNet, pode ser aplicado a três marcadores lipídicos comuns, APOE, Nile Red e BODIPY, e fornece um método rápido e automático de análise que permite que a quantificação seja padrão e imparcial.
A principal limitação do LipidUNet é o fato de que o conjunto de dados de treinamento para a IA foi limitado a imagens de aumento de 40x de células cultivadas em uma placa de 96 poços. Como resultado do conjunto de imagens de treinamento, o LipidUNet, em sua forma atual, limita-se a analisar imagens de aumento de 40x. O software pode ser usado para analisar imagens de 40x de células cultivadas em outras superfícies de cultura além de uma placa de 96 poços, mas deve-se ter cuidado ao examinar as máscaras de saída geradas para verificar o limiar preciso pelo software. Mais conjuntos de imagens (em diferentes ampliações) serão necessários para expandir o escopo de quais amostras/imagens ele pode analisar.
O protocolo tem várias etapas críticas. Na etapa do marcador lipídico, o usuário deve confirmar que seu composto de rotulagem escolhido (BODIPY, APOE, Nile Red) rotulou sua amostra de forma eficaz. As células maduras do EPR são frequentemente fortemente pigmentadas, o que pode prejudicar o sinal fluorescente da imunomarcação de anticorpos. Quando o sinal de fluorescência é fraco ou quando há muita coloração de fundo, LipidUNet não pode discernir gotículas lipídicas com precisão. Por uma razão semelhante, configurações de aquisição adequadamente selecionadas para a etapa de aquisição automática do protocolo devem ser usadas. Se as imagens adquiridas forem de baixa qualidade, o LipidUNet terá dificuldades para mascarar adequadamente as imagens e, portanto, a quantificação será imprecisa (Figura 6A-L). Finalmente, o pós-processamento das imagens é um passo importante, pois o LipidUNet possui requisitos específicos para que o software funcione.
Quando comparado a fluxos de trabalho para análise lipídica que usam limiares manuais ou técnicas que envolvem limiares automáticos em softwares como Fiji, o LipidUNet oferece uma segmentação não tendenciosa e confiável em imagens com deposição lipídica variável, refletida por uma pequena taxa de erro na identificação de partículas lipídicas (Figura 7). O software permite a entrada pelo usuário de imagens adicionais de treinamento, permitindo a análise de conjuntos de imagens além daquelas que utilizam uma objetiva de aumento de 40x ou mesmo aquelas que utilizam um marcador lipídico diferente, conforme descrito no protocolo. No futuro, o software será treinado para analisar imagens 3D para que a quantificação do volume de depósito lipídico seja possível. Doenças oculares degenerativas que implicam a deposição lipídica como um dos principais contribuintes para a patologia são prevalentes, e prevê-se que os casos aumentem à medida que a população idosa está se expandindo13. Modelos de doença precisos e ferramentas de análise eficientes, como delineamos neste protocolo, permitirão o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao núcleo de histologia do National Eye Institute (NEI) pelo uso do sistema confocal Zeiss. Este trabalho foi apoiado por fundos do NEI IRP (número de processo ZIA EY000533-04).
0.22 µm Steriflip filter system | EMD Millipore | SCGP00525 | |
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma | T5516 | |
Albumin Bovine, Fraction V | MP Biomedical | 160069 | |
Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A21431 | APOE secondary antibody |
APOE primary antibody | Millipore Sigma | AB947 | |
BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Protect from light |
Complement competent human serum | Millipore Sigma | S1-LITER | |
CTS N2 Supplement | Life Technologies | A13707-01 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Slide mounting media |
Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm | Electron Microscopy Sciences | 72204-01 | |
Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick | Electron Microscopy Sciences | 71870-01 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
MEM Alpha | Life Technologies | 12571-063 | |
MEM non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
Nile Red | Sigma | 72485-100MG | Protect from light |
Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Penicillin-Strep | Life Technologies | 15140-148 | |
Phosphate Buffered Saline 10x | Gibco | 70011-044 | |
Rod Outer Segments (OS) | InVision Bioresources | 98740 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
SYBR Green Master Mix | Bio-Rad | 1725274 | |
Taurine | Sigma | T0625 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
Tween 20 Ultrapure | Affymetrix | 9005-64-5 | |
Vitronectin | Life Technologies | A14701SA | |
Y-27632 dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |