眼の網膜色素上皮層に影響を及ぼす変性眼疾患は、単一遺伝子および多遺伝子起源を有する。いくつかの疾患モデルとソフトウェアアプリケーションであるLipidUNetは、疾患のメカニズムと潜在的な治療介入を研究するために開発されました。
網膜色素上皮(RPE)は、目の後ろにある六角形の細胞の単層です。光受容体と脈絡膜毛細血管に栄養とサポートを提供し、光受容体外側セグメント(POS)の食作用を行い、外網膜の恒常性を維持するために二極的にサイトカインを分泌します。突然変異、加齢、環境要因によって引き起こされる機能不全のRPEは、他の網膜層の変性をもたらし、視力喪失を引き起こします。変性RPEの特徴的な表現型の特徴は、細胞内および細胞内の脂質リッチ沈着物です。これらの沈着物は、さまざまな網膜変性疾患に共通の表現型です。単遺伝子網膜変性の脂質沈着表現型を in vitroで再現するために、患者の線維芽細胞から人工多能性幹細胞由来RPE(iRPE)を作製した。Stargardtおよび遅発性網膜変性症(L-ORD)の患者から作製した細胞株にPOSを7日間与えて、RPE生理機能を再現し、これらの疾患でPOS食作用誘発病理を引き起こしました。代替補体活性化に関連する多遺伝子性疾患である加齢黄斑変性症(AMD)のモデルを生成するために、iRPEは代替補体アナフィラトキシンで挑戦されました。細胞内および細胞内脂質沈着物は、ナイルレッド、ホウ素ジピロメテン(BODIPY)、およびアポリポタンパク質E(APOE)を使用して特徴付けられました。脂質沈着物の密度を定量化するために、機械学習ベースのソフトウェアであるLipidUNetが開発されました。このソフトウェアは、培養表面上のiRPEの最大強度投影画像でトレーニングされました。将来的には、3次元(3D)画像を解析し、脂肪滴の体積を定量化するように訓練される予定です。LipidUNetソフトウェアは、疾患モデルにおける脂質蓄積を減少させる薬剤を発見するための貴重なリソースとなるでしょう。
網膜色素上皮(RPE)は、網膜光受容体に隣接する眼の後ろに位置する細胞の単層です。RPEは、光受容体に代謝的および構造的サポートを提供することにより、適切な視力を維持する上で重要な役割を果たします。健康なRPE細胞は、明確な六方晶形態によって特徴付けられる。それらはタイトジャンクションによって接続されており、RPEはその基底側に位置する絨毛毛細血管と頂端に位置する光受容体との間の障壁として作用することを可能にする。網膜生態系を維持するために、RPEは、RPE1におけるグルコース消費を最小限に抑える方法で、主要な代謝産物、例えばグルコースを光受容体にシャトルする。この制限により、RPEは、β酸化によってケトンに変換する脂肪酸を含む、代謝ニーズを維持するために他の代謝物に依存しています2。視細胞外帯(POS)消化からリサイクルされる可能性が高い脂肪酸をエネルギー源として利用するRPEの傾向を考えると、RPEの脂質処理経路の有害な変化は、単遺伝子性および多遺伝子性変性網膜疾患の両方につながるか、関与することがよくあります3。
RPE変性を引き起こす多遺伝子性変性眼疾患である加齢黄斑変性症(AMD)も、RPE単層における異常なオートファジーおよび脂質代謝に関連しています。機能不全のRPE単層がPOSを処理し、他の重要な機能を実行できないと、RPEとブルッフ膜の間に位置する基底線形沈着物(BLinD)と呼ばれる細胞外(サブRPE)沈着物が発生します-AMD病理の特徴です。BLinDの主成分にはリポタンパク質が含まれ、その中で最も豊富なのはアポリポタンパク質E(APOE)4です。BLinDの薄層の蓄積は、AMD 5,6の臨床症状として認識されている柔らかいドルーセンにつながる可能性があります。
いくつかのグループは、RPE機能障害を引き起こす幹細胞由来のin vitro疾患モデルがサブRPE脂質蓄積を特徴とすることを示しています7、8、9。Hallam et al. (2017)は、CFH遺伝子の多型によりAMDのリスクが高い患者から人工多能性幹細胞由来RPE(iRPE)を生成しました。iRPEはAPOEでマークされるようにドルーゼン蓄積を示し、高リスクRPEは低リスク患者から生成されたiRPEよりも大きな沈着物を蓄積しました10。
脂肪滴やドルーゼン沈着などのAMDの細胞の特徴を再現する in vitro モデルを作成するために、患者の血液サンプルから生成されたiRPEラインを、以前に公開された発達ガイドプロトコル11を使用して確立しました。iRPEは、AMDの考えられる原因の1つである代替補体シグナル伝達の増加を模倣するアナフィラトキシンを含む溶液である補体コンピテントヒト血清(CC-HS)に供されました8。得られた脂質沈着物の細胞内沈着を、一般的に使用される脂質およびリポタンパク質マーカー、APOE、ナイルレッド、およびBODIPYを用いて測定した。これらのマーカーを通じて、CC-HSを介した活性化補体シグナル伝達がiRPE細胞8における脂質蓄積を悪化させることが示された。
単遺伝子網膜変性疾患の疾患モデルを開発するために、RPEの ABCA4 遺伝子の変異によって引き起こされる疾患であるスターガルト病の患者からiRPE株を開発しました。 ABCA4 がノックアウトされると、高レベルのリン脂質と光依存性脂質過酸化生成物を含むことが知られている細胞内沈着物であるA2EリポフスチンがRPE12の内部に蓄積することが以前に示されています。 ABCA4 ノックアウトラインは患者ラインと一緒に開発され、両方ともPOS給餌を受けました。Stargardt iRPEは、POS食作用誘発病理を示し、BODIPY染色によって定量化された脂質蓄積の増加を示しました。 ABCA4 KO由来のRPEをCC-HS処理した。BODIPYシグナルの定量化は、同様にスターガルト病モデルにおける脂質取り扱いの欠陥を示した9。
これらの疾患の有病率と効果的な治療法の必要性を考えると、上記の関連する疾患モデルとともに、潜在的な治療法の有効性を定量化するための堅牢な方法を確立する必要があります。客観的、自動化、標準化された方法で脂質沈着を定量するために、機械学習ベースのソフトウェアであるLipidUNetが作成され、マスク分析ツールと組み合わせると、一般的なマーカーであるNile Red、BODIPY、およびAPOEを使用して脂質沈着を迅速かつ効果的に識別できます。この分析パイプラインを使用して得られた要約統計量は、分析してグラフィカルに表示することができ、治療条件の比較が容易になります。プロトコルの回路図を 図1に示します。
図1:プロトコルの概略図:RPE細胞を96ウェルプレート上で増殖させ、活性ヒト血清または精製ウシ外側セグメントでチャレンジして、in vitroでさまざまな種類の網膜変性をモデル化します。RPE細胞は、ナイルレッド、ボディピー、およびAPOEでリポタンパク質沈着物について固定および染色されます。共焦点顕微鏡を使用して、蛍光標識された脂質粒子のZスタックを取得し、その後、2D最大強度投影に加工します。機械学習アルゴリズムは、リポタンパク質粒子を認識して正しくセグメント化するようにトレーニングされました。粒子数とさまざまな形状メトリックを含むサマリーテーブルが生成され、その後のプロットと統計分析に使用できます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
このプロトコルは、変性眼疾患の単一遺伝子および多遺伝子 のin vitro 疾患モデルにおいて脂質沈着を効率的に標識、画像化、および定量する方法を提供します。AIベースのソフトウェアであるLipidUNetは、APOE、ナイルレッド、およびBODIPYの3つの一般的な脂質マーカーに適用でき、定量を標準的かつ偏りのない高速自動分析方法を提供します。
LipidUNetの主な制限は、AIのトレーニングデータセットが96ウェルプレートで培養された細胞の40倍の倍率画像に制限されていたという事実です。トレーニング画像セットの結果として、LipidUNetは、現在の形式では、40倍の倍率画像の分析に限定されます。このソフトウェアは、96ウェルプレート以外の他の培養表面で培養された細胞の40倍の画像を分析するために使用できますが、ソフトウェアによる正確な閾値を検証するために、生成された出力マスクを調べるように注意する必要があります。分析できるサンプル/画像の範囲を拡大するには、より多くの画像セット(異なる倍率)が必要になります。
プロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。脂質マーカーステップでは、ユーザーは選択した標識化合物(BODIPY、APOE、ナイルレッド)がサンプルを効果的に標識したことを確認する必要があります。成熟RPE細胞は色素沈着が強いことが多く、抗体免疫染色の蛍光シグナルを損なう可能性があります。蛍光シグナルが弱い場合やバックグラウンド染色が多すぎる場合、LipidUNetは脂肪滴を正確に識別できません。同様の理由から、プロトコルの自動イメージングステップに対して適切に選択された取得設定を使用する必要があります。取得した画像の品質が低い場合、LipidUNetは画像を適切にマスクするのに苦労するため、定量化は不正確になります(図6A-L)。最後に、LipidUNetにはソフトウェアが機能するための特定の要件があるため、画像の後処理は重要なステップです。
手動閾値を使用する脂質分析のワークフロー、またはフィジーのようなソフトウェアで自動閾値化を含む技術と比較すると、LipidUNetは、脂質粒子の同定における小さなエラー率に反映されるように、可変脂質沈着を伴う画像全体で非バイアスで信頼性の高いセグメンテーションを提供します(図7)。このソフトウェアでは、追加のトレーニング画像をユーザーが入力できるため、プロトコルで概説されているように、40倍の倍率の対物レンズを利用する画像セットや、異なる脂質マーカーを利用する画像セットの解析も可能です。将来的には、脂質沈着量の定量化が可能になるように、3D画像を解析するようにソフトウェアをトレーニングする予定です。脂質沈着を病態の主な原因とする変性眼疾患が蔓延しており、高齢者人口の拡大に伴い症例が増加すると予測されています13。このプロトコルで概説したように、正確な疾患モデルと効率的な分析ツールは、新しい治療介入の開発を可能にします。
The authors have nothing to disclose.
ツァイス共焦点システムの使用について、国立眼科研究所(NEI)の組織学コアに感謝します。この作業は、NEI IRP基金(助成金番号ZIA EY000533-04)によって支援されました。
0.22 µm Steriflip filter system | EMD Millipore | SCGP00525 | |
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma | T5516 | |
Albumin Bovine, Fraction V | MP Biomedical | 160069 | |
Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A21431 | APOE secondary antibody |
APOE primary antibody | Millipore Sigma | AB947 | |
BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Protect from light |
Complement competent human serum | Millipore Sigma | S1-LITER | |
CTS N2 Supplement | Life Technologies | A13707-01 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Slide mounting media |
Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm | Electron Microscopy Sciences | 72204-01 | |
Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick | Electron Microscopy Sciences | 71870-01 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
MEM Alpha | Life Technologies | 12571-063 | |
MEM non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
Nile Red | Sigma | 72485-100MG | Protect from light |
Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Penicillin-Strep | Life Technologies | 15140-148 | |
Phosphate Buffered Saline 10x | Gibco | 70011-044 | |
Rod Outer Segments (OS) | InVision Bioresources | 98740 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
SYBR Green Master Mix | Bio-Rad | 1725274 | |
Taurine | Sigma | T0625 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
Tween 20 Ultrapure | Affymetrix | 9005-64-5 | |
Vitronectin | Life Technologies | A14701SA | |
Y-27632 dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |