이 프로토콜은 성인 제브라피쉬에서 여러 꼬리 근소체의 심각한 손상을 유도하는 냉동 손상 모델을 설명합니다. 이 방법은 비포유류 척추동물에서 심각한 조직 손실 후 골격근 재생을 연구하기 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다.
골격근은 위성과 같은 줄기 세포의 활성화를 통해 경미한 손상 후 재생 및 회복을 거칩니다. 근육 조직의 심한 부상은 종종 인간의 섬유증을 유발합니다. 포유류에 비해 제브라피쉬는 장기 재생에 대한 타고난 능력이 더 높기 때문에 장기에 대한 광범위한 손상 후 조직 복원을 연구하기 위한 강력한 모델을 제공합니다. 여기에서 냉동 손상 모델은 성인 제브라피쉬에서 꼬리 꽃자루의 4개 자궁근에 심각한 손상을 유도하는 것으로 설명됩니다. 맞춤형 크라이오프로브는 체형에 맞게 설계되었으며 피부에서 정중선까지 측면 근육을 재현성 있게 손상시킵니다. 중요한 것은 신체의 완전성이 손상되지 않았으며 물고기는 수영 활동을 계속했습니다. 골격근의 변화는 조직 절편에서 육종 단백질의 조직학적 염색 및 형광 염색에 의해 평가되었습니다. 이 방법은 골격근의 퇴행이 어떻게 회복 반응을 유도하여 성인 제브라 피쉬에서 근 형성 프로그램의 재 활성화를 유도하는지 이해하는 것을 목표로하는 새로운 연구 길을 열어 줄 것입니다.
척추 동물에서 다양한 조직의 손상된 부분은 평생 동안 항상성 재생 및 복원을 거칩니다. 이러한 재생 및 회복 능력은 전형적으로 유능한 줄기 세포의 존재 또는 성숙한 세포의 증식 능력에 달려 있다 1,2. 골격근은 위성 세포라고 불리는 국소 줄기 세포와 관련된 유사분열 후 근섬유로 구성됩니다 3,4,5,6. 따라서,이 조직에는 연속성이 중단 된 영역을 효율적으로 밀봉하거나 경미한 상처를 복구하기위한 세포 공급원이 포함되어 있습니다. 그러나 포유류 골격근의 체적 손실이 커지면 섬유증(fibrosis)과 같은 비재생 복구가 뒤따르는 경우가 많다7. 동물 모델은 광범위하게 손상된 장기의 재생을 촉진하는 생물학적 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
제브라피쉬는 높은 재생 능력을 가진 잘 정립된 모델 유기체입니다. 성체 제브라피쉬는 꼬리 지느러미의 절단된 부분이나 심장 심실의 절제된 정점을 재생할 수 있습니다 8,9,10,11. 또한, 제브라피쉬12,13,14,15의 지느러미와 심장 재생을 연구하기 위해 냉동 손상 방법이 이전에 적용되었습니다. 내부 장기의 경우, 냉동 손상 방법은 장기 무결성을 방해하지 않고 세포 사멸을 유도하여 생리적 조건을 모방하는 이점이 있습니다16,17. 조직 파편은 상처 치유 중 자연 제거에 의해 분해되고 회복 과정이 뒤 따른다. 그러나 이 방법이 골격근에 적용될 수 있는지 여부는 아직 확립되지 않았습니다.
물고기의 경우, 측면 근육은 수영하는 동안 몸통을 좌우로 구부릴 수 있게 한다18. 골격근은 결합 조직 5,19에 의해 분리되는 자궁 내막이라고 불리는 metameric 단위로 구성됩니다. 제브라피쉬는 레이저 절제나 찔린 상처 20,21,22,23,24와 같은 경미한 조직 파괴 후에 근육을 재생할 수 있지만 광범위한 손상 후에 전체 자궁근이 재생될 수 있는지 여부는 아직 알려지지 않았습니다. 이러한 지식의 격차는 아마도 적절한 부상 모델이 없기 때문일 것입니다. 이 프로토콜은 여러 자궁 근막에 걸쳐 골격근의 광범위한 손상을 유도하는 새로운 접근 방식을 설정합니다. 설명된 cryoinjury 방법은 사전 냉각된 스테인리스 스틸 기기를 사용하여 근섬유를 급속 동결 및 해동하는 것을 기반으로 합니다. 광범위한 피해에도 불구하고 물고기의 안녕은 심각하게 손상되지 않았습니다. 전체 자궁 내막이 복원 될 수 있으며,이 연구는 성인 제브라 피쉬의 근육 재생 메커니즘을 연구하기위한 새로운 모델 시스템을 제공합니다.
제브라피쉬는 근육 재생 메커니즘을 연구하기 위해 anamniote 척추동물 모델 유기체를 제공합니다. 레이저 절제술 또는 찔린 상처와 같은 현존하는 대부분의 부상 방법은 비교적 경미한 조직 파괴를 초래한다20,21,22,23. 외안근26에 대한 주요 절제술이 시행되었습니다. 그러나 이 외과적 접근은 체벽 절단의 건강상의 위험 때문에 외측 근육계에 적합하지 않을 수 있습니다. 이러한 침습적 절차를 피하기 위해 이 프로토콜은 꼬리 꽃자루에 심각한 손상을 초래하는 경미한 형태의 부상을 설명합니다. 이 접근법은 신체의 한쪽에 있는 몇 개의 근섬유를 매우 정밀하게 표적화할 수 있는 피상적인 조작에 의존합니다. cryoinjury 모델의 강점은 재현성과 광범위한 근육 퇴행을 생성하는 능력에 있습니다. 이러한 강점을 바탕으로 이 모델은 신체가 상당한 근육 손실에 어떻게 반응하는지 연구할 수 있는 새로운 경로를 제공합니다.
극한의 추위가 가해지면 열 충격이 일어나 영향을 받는 근육 조직의 원형질막과 세포 소기관이 파괴됩니다(27). 결과적으로, 손상된 근섬유는 “우발적인” 세포 사멸을 겪는다28. 결과적으로, 손상된 조직은 상처 제거의 자연적 메커니즘에 의해 재 흡수 될 수 있습니다. Zebrafish는 사전 냉각된 프로브가 정확한 기간 동안 신체에 올바르게 배치되었다는 점을 감안할 때 이 연구의 생존율이 거의 100%였기 때문에 냉동 손상 절차를 잘 견뎌냅니다. 그러나 상처가 너무 광범위하면(예: 너무 많은 압력이 가해지거나 냉동 손상 기간이 너무 긴 경우) 물고기는 시술 직후 비정상적인 수영 동작을 보일 수 있으며 동물은 인도적 종점으로 안락사되어야 합니다. 다른 어종의 경우 cryoprobe에 대한 노출 시간은 신체의 크기에 따라 조정되어야 합니다.
냉동 손상 후 물고기는 비정상적인 움직임의 증상없이 수영 활동을 재개 할 수 있습니다. 그러나 냉동 부상당한 물고기는 대조군 물고기보다 덜 역동적으로 헤엄치며 이는 약간의 경미한 장애를 나타냅니다. 냉동 손상 후 다른 시점에서 물고기 행동의 추가 정량화는 수영 성능의 시간적 변화를 결정하는 데 필요합니다.
꼬리 꽃자루의 다른 비근육 조직에 대한 냉동 손상 방법의 효과는 아직 밝혀지지 않았습니다. 분명히, 가장 바깥쪽의 체층(즉, 피부)은 절차에 의해 손상됩니다. 이러한 맥락에서 냉동 손상 방법은 상처 치유, 비늘 재생 및 색소 침착 패턴의 복원을 연구하는 새로운 전략을 제공할 수 있습니다. 또한, 자궁 내막의 혈관 구조와 신경 분포도 냉동 손상의 영향을받을 수 있으며 이러한 주제는 추가 조사가 필요합니다.
cryoinjury 모델은 이전에 제브라피쉬 심장 재생13,14,15,29를 조사하는 데 사용되었습니다. 이 방법은 콜라겐이 풍부한 흉터의 일시적인 침착으로 인해 심실 절제법(10)에 비해 몇 가지 이점을 보여주었으며, 이는 인간30의 경색 치유 반응을 더 잘 모방한다. 놀랍게도, 제브라피쉬는 여러 번의 냉동 손상 후에 심장을 재생할 수 있습니다31. 흥미롭게도, cryoinjury는 제브라 피쉬 지느러미에도 적용되어 조직 분해 과정을 초래했다12. 고전적인 지느러미 절단과 달리 나머지 냉동 손상 그루터기에는 죽은 물질과 건강한 세포가 혼합된 왜곡된 가장자리가 있습니다. 제브라피쉬 기관인 심장과 지느러미를 모두 대상으로 한 연구에 따르면 제브라피쉬가 광범위한 조직 손상 후에도 원래의 기능적 구성 요소를 복원하는 강력한 능력이 밝혀졌습니다. 냉동 손상된 골격근이 회복 과정과 재생 과정 사이의 상호 작용을 활성화하는지 여부는 향후 연구를 보증합니다.
The authors have nothing to disclose.
물고기 관리에 대해 V. Zimmermann과 이 프로젝트의 시작과 예비 결과에 대해 Thomas Bise 박사, Catherine Pfefferli 박사 및 Lea Gigon에게 감사드립니다. 이 연구는 스위스 국립 과학 재단 (Swiss National Science Foundation)의 보조금 번호 310030_208170의 지원을 받았습니다.
Program | |||
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
Photoshop Version 23.5.3 | Adobe | ||
Material/ Equipment | |||
35/10 mm Petri Dish | Greiner Bio-one | Item No.: 627102 | |
Camera | Sony | / | HDR-PJ410 |
Cryostat | Histcom | HRA C50 | |
Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 | |
Macro 50 mm f/2.8 EX DG lens | Sigma | / | Discontinued lense |
Peel-A-Way Embedding Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 | |
Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Sponge | any | any | flat sponge, c.a. 7cm x 3 cm x 1 cm |
Stainless steel cryoprobe | Custom-made | / | specifics in the article |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
Surgical scissors | Any | / | |
TCS SP2 | Leica | / | Discontinoued product |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 | |
Dyes and Antibodies | |||
Dapi | Sigma | 10236276001 | Concentration: 1/2000 |
Phalloidin-Atto-565 (F-actin) | Sigma | 94072 | Concentration: 1 / 500 |
Tropomyosin (TPM1) | DHSB | CH1 | Concentration: 1 / 50 |
Recipies/Solutions | |||
1x PBS | 123 mM NaCl | Sigma | |
2.7 mM KCl | Sigma | ||
10 mM Na2HPO4 | Sigma | ||
1.8 mM KH2PO4 | Sigma | ||
AFOG solution | 3 g Fuchsin | Fisher Scientific | |
2 g Orange G | Sigma | ||
1 g Anilin blue | Fulka AG | ||
200 ml acifidied distilled H2O (pH 1.1) |