ゼブラフィッシュ成体における尾柄の骨格筋再生研究のための凍結損傷モデル

凍結損傷後の魚のモニタリング動物に対するミオメア凍結損傷の影響を決定するために、凍結損傷後1日目の対照および凍結損傷魚のビデオ記録(dpci)および5 dpciが行われました。各グループには5匹の魚が含まれていました。1dpciでは、凍結損傷した魚は活発に泳ぐことができませんでしたが、渦巻き、畳み込み、平衡の低下などの異常な動きは見られませんでした(ビデオ1)。畜産システムでは、タンク内の位置と食物摂取量は、無傷の魚の位置と同様でした。通常の動作は、5 dpci のビデオ (ビデオ 2) に示されているように、次の数日間にわたって持続しました。結論として、尾柄の凍結損傷手順は動物の健康に深刻な影響を与えませんでした。 尾柄切片の組織学的解析損傷の程度を評価するために、筋線維の破片が創傷に完全に吸収されたときであるため、4 dpciの時点が選択されました。体の背腹軸と前後軸に沿った凍結損傷の影響を分析するために、2つのグループの魚が使用されました(つまり、それぞれ、尾柄の冠状および横方向のセクション)(図1F)。 切片は、アニリンブルー、アシッドフクシン、およびオレンジG(AFOG)で構成されるトリクローム染色によって分析されました。この試薬の組み合わせを使用して、無傷の筋肉をオレンジ色、脊髄を濃い赤、コラーゲンマトリックスを青色で示しました。魚の筋肉組織のメタメリック単位である損傷した筋腫の数を決定するために、一連のセクションが分析されました(図2)。ミオコンマタと呼ばれるミオメア境界は、青色の着色によって検出されたコラーゲン沈着によって同定された。損傷領域は、オレンジ色の染色がないことによって決定されました。明らかなミオコンマタを有する標本を詳しく調べたところ、オレンジ染色の欠如から推測されるように、約4つの連続したミオメアが損傷していることが明らかになりました(n、魚の数= 4;図3A,A’)。同じ魚の無傷の側が内部基準として機能しました。 体軸に垂直な創傷の深さを調べるために、4dpciおよび7dpciのゼブラフィッシュを用いて横断切片を作製した。後者の時点は、筋原性プログラムの活性化、したがって筋肉再生の開始に対応する。これらの標本のAFOG染色は、体の凍結損傷を受けた脇腹にオレンジ色の染色が広範囲に欠如していることを示し、変性した骨格筋のゾーンを画定しました(図3B、C)。4 dpciおよび7 dpciでは、創傷領域は皮膚から垂直中隔に向かって組織にまたがっていた。これは、凍結損傷法が尾柄の外側半分を深く標的とし、手術後7日間は機能的な筋肉を欠いていたことを示しています。まとめると、4つの筋腫が尾柄の片側に深刻な損傷を与えました。 横断切片の免疫蛍光分析筋肉再生のダイナミクスを評価するために、魚の実験グループは4 dpci、7 dpci、10 dpci、および30 dpciで安楽死させました。尾柄の横断切片は、糸状アクチン[F-アクチン]に結合するファロイジン、サルコメアタンパク質を検出するトロポミオシン-1抗体、および核を標識するDAPIを用いた多色蛍光染色によって標識されました。すべての時点で、体の無傷の半分が内部統制を提供しました。F-アクチンとトロポミオシン1の両方が無傷の対照部分で強く検出され、損傷していない組織を示しています(図4)。 4 dpciでは、尾柄の損傷側には豊富なDAPI陽性細胞が含まれていましたが、F-アクチンとトロポミオシン1の免疫蛍光はほとんどまたはまったく観察されず、筋肉が変性した創傷領域を示しています(図4A-B ́)。7 dpciでは、トロポミオシン1とF-アクチンが垂直体の正中線に近い創傷の一部で検出されました(図4C-D ‘)。この発現パターンは、新しい筋線維の形成が尾柄で始まる位置を画定します。10 dpciでは、両方の筋肉マーカーが体の表面に向かって拡大し、骨格筋の再生が進んでいることが示唆されました(図4E-F ́)。30 dpciでは、体の両側でF-アクチン染色の同様の分布が示されました(図4G-H ́)。この所見は、尾柄の凍結損傷後に骨格筋が効率的に回復したことを示しています。 図1:ミオメア凍結損傷の実験セットアップ。 (A)ステンレス鋼製のカスタム製造クライオプローブの寸法。器具の遠位部分は、ゼブラフィッシュの体の湾曲を考慮して、深さ1mmの凹状のエッジを持つヘラで構成されています。ツールの中央部分は、おもりとして機能するシリンダーと、手順中にスパチュラの低温を維持するためのリザーバーで構成されています。器具の近位端は薄い金属製のハンドルの形をしています。(B,C)湿ったスポンジの上に成魚を麻酔し、尾柄にクライオプローブを付けます。プローブは室温であった。(B)プローブの縁を尾柄付近に水平に配置し、魚と道具の相対的なサイズを表示します。(C)凍結損傷の場合、ツールの先端は魚に対して垂直に配置されます。(D)操作を包括的に示すための魚の腹側からの凍結損傷手順の概略図。クライオプローブを液体窒素で予冷し、すぐに魚の片側に6秒間置いた。 (E)凍結損傷後の特定の時点で、魚は安楽死させられ、固定のために尾柄が収集されました。(F)固定された材料を組織学的に処理し、冠状面または横面に沿って切片化した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:尾柄の背側から腹側位置までの損傷した筋腫の組織学的解析。 凍結損傷後4日目の一連の冠状切片のAFOG染色(dpci)。セクションは、最初と最後のパネルの上部に示されているように、背側から腹側に向かっています。セクションは隣接しておらず、それらの間には約150μmの間隔があります。損傷していない筋肉は筋肉のオレンジ色の染色によって検出されますが、損傷した組織はこの染色がなく、灰色がかって見えます(破線で囲まれた領域)。皮膚などのコラーゲン含有組織は青色に染色されています。脊髄は棒状の構造として現れ、赤く染まっています。魚の数、n = 4。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:AFOG染色を用いた尾柄の損傷の深さの評価。 (A,A’)冠状断面は脊髄(赤く染まった水平棒)の高さにあります。下の画像は、上の画像の枠で囲まれた拡大領域を示しています。連続するミオメア境界は、脊髄に対して斜めに配置されたコラーゲン状の縞模様(青)として現れる(拡大画像A’の赤い矢印)。(B,C)断面には、オレンジ色に染まった筋肉のある無傷の脇腹と、灰色がかった染色のある凍結傷の脇腹が表示されます。損傷した領域は黒い破線で囲まれています。垂直セプタム(赤い破線で描かれている)は、体をコントロール側と凍結損傷側に細分化します。魚の数、n = 4時点あたり。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:凍結損傷後の筋タンパク質の免疫蛍光検出。パネルの左側および上部にラベル付けされた4 dpci、7 dpci、10 dpci、および30 dpciでの断面の蛍光染色(A-B ́)。4 dpciでは、損傷した組織(破線で囲まれた部分)はDAPI陽性(青)ですが、ファロイジン染色(緑)またはトロポミオシン-1免疫反応性(赤)がなく、凍結損傷後の筋線維の変性を示唆しています。(C-D’)7 dpciでは、両方の筋肉マーカーが負傷領域に徐々に出現し、再生過程を示します。トロポミオシン-1は、新しく形成された繊維においてF-アクチンよりも強く見える。(E-F’)10 dpciでは、損傷ゾーンは、F-アクチンと比較してより高い強度のトロポミオシン-1免疫反応性を示す新しい筋線維で満たされます。(G-H’)30 dpciでは、体の両側に同様のパターンの筋線維が検出されます。パネル A、C、E、H のフレームは、右側の隣接する画像で拡大された領域を囲みます。ミオメアの外側で蛍光を発する真皮の鱗屑は、Adobe Photoshopを使用して画像から消去されました。魚の数、n = 4時点あたり。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。