JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Een cryoletselmodel voor het bestuderen van skeletspierregeneratie van de caudale steel bij volwassen zebravissen

Published: July 07, 2023
doi:
10.3791/65491
, ,
1Department of Biology,University of Fribourg

Summary

Dit protocol beschrijft een cryoinjury-model om diepgaande schade aan verschillende caudale myomeren bij volwassen zebravissen te induceren. Deze methode biedt een nieuwe benadering voor het bestuderen van skeletspierregeneratie na ernstig verlies van weefsel bij gewervelde dieren van niet-zoogdieren.

Abstract

Skeletspieren ondergaan vernieuwing en herstel na klein letsel door de activering van satellietachtige stamcellen. Ernstige verwondingen van de musculatuur leiden vaak tot fibrose bij de mens. In vergelijking met zoogdieren bezitten zebravissen een hoger aangeboren vermogen voor orgaanregeneratie, wat een krachtig model biedt voor het bestuderen van weefselherstel na uitgebreide schade aan het orgaan. Hier wordt een cryoinjury-model beschreven om ernstige schade aan vier myomeren van de staartkraag bij volwassen zebravissen te veroorzaken. Een op maat gemaakte cryoprobe is ontworpen om bij de lichaamsvorm te passen en reproduceerbaar de laterale musculatuur van de huid tot de middellijn te verwonden. Belangrijk is dat de integriteit van het lichaam intact bleef en dat de vissen hun zwemactiviteit voortzetten. Veranderingen in de skeletspieren werden beoordeeld door histologische kleuring en fluorescentiekleuring van sarcomerische eiwitten op weefselsecties. Deze methode zal nieuwe wegen van onderzoek openen om te begrijpen hoe de degeneratie van de skeletspieren herstelreacties induceert en dus de reactivering van het myogene programma bij volwassen zebravissen.

Introduction

Bij gewervelde dieren ondergaan beschadigde delen van verschillende weefsels homeostatische vernieuwing en herstel tijdens de levensduur. Dit vermogen tot vernieuwing en herstel hangt doorgaans af van de aanwezigheid van competente stamcellen of het proliferatieve vermogen van de rijpe cellen 1,2. Skeletspieren bestaan uit post-mitotische myovezels, die geassocieerd zijn met lokale stamcellen, satellietcellen 3,4,5,6 genoemd. Dit weefsel bevat dus cellulaire bronnen voor de efficiënte afdichting van gebieden met onderbroken continuïteit of voor het herstel van kleine wonden. Grotere volumetrische verliezen in skeletspieren van zoogdieren worden echter vaak gevolgd door niet-regeneratief herstel, zoals fibrose7. Diermodellen kunnen nieuwe inzichten verschaffen in de biologische mechanismen die de regeneratie van zwaar beschadigde organen bevorderen.

De zebravis is een goed ingeburgerd modelorganisme met een hoog regeneratief vermogen. Volwassen zebravissen kunnen een geamputeerd deel van hun staartvin of de gereseceerde top van de hartkamer 8,9,10,11 regenereren. Daarnaast is eerder een cryoinjury-methode toegepast om vin- en hartregeneratie bij zebravissente bestuderen 12,13,14,15. In het geval van inwendige organen heeft de cryoinjury-methode het voordeel dat celdood wordt geïnduceerd zonder de integriteit van het orgaan te verstoren, waardoor fysiologische omstandigheden worden nagebootst16,17. Weefselresten worden gedesintegreerd door natuurlijke klaring tijdens wondgenezing, gevolgd door de herstelprocessen. Of deze methode echter kan worden toegepast op skeletspieren moet nog worden vastgesteld.

Bij vissen maakt de laterale musculatuur het zijwaarts buigen van de stam mogelijk tijdens het zwemmen18. De skeletspieren zijn georganiseerd in metamere eenheden, myomeren genaamd, die worden gescheiden door bindweefsel 5,19. Zebravissen kunnen hun spier regenereren na kleine weefselverstoringen, zoals die veroorzaakt door laserablatie of een steekwond 20,21,22,23,24, maar of hele myomeren kunnen regenereren na uitgebreid letsel blijft onbekend. Deze lacune in kennis is waarschijnlijk te wijten aan het ontbreken van een geschikt letselmodel. Dit protocol stelt een nieuwe aanpak vast om uitgebreid letsel van de skeletspieren te induceren, verspreid over meerdere myomeren. De beschreven cryoinjury methode is gebaseerd op het snel invriezen en ontdooien van de myofibers met een voorgekoeld rvs instrument. Ondanks de grote schade was het welzijn van de vissen niet ernstig aangetast. Hele myomeren kunnen worden hersteld, en dus biedt dit werk een nieuw modelsysteem voor het bestuderen van de mechanismen van spierregeneratie bij volwassen zebravissen.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante ethische voorschriften. De zebravissen werden gefokt, grootgebracht en onderhouden in overeenstemming met de richtlijnen van de Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA)25. De huisvesting van de dieren en alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het kantonnale veterinaire kantoor van Fribourg, Zwitserland. 1. Apparatuur en setup Regel de productie van een roestvrijstalen cryoprobe in een technische werkplaats die instrumenten voor onderzoek kan vervaardigen.OPMERKING: Geef een ontwerp van het instrument met de specifieke afmetingen (figuur 1A). Om bevriezing tijdens het hanteren van de sonde tijdens de procedure te voorkomen, steekt u het handvat in een pipetpunt en wikkelt u het met tape. Bereid een bekerglas voor op de anesthesie-werkoplossing, een lepel voor het hanteren van de vis, een vochtige spons en een tank met systeemwater om de vis na de procedure te laten herstellen. Bereid de werkoplossing voor elk experiment vers voor. Om de werkoplossing te bereiden, voegt u 4 ml Tricaine-stamoplossing toe aan 100 ml systeemwater in een bekerglas.OPMERKING: De anesthesie-stamoplossing bestaat uit 4 g Tricaïne opgelost in 980 ml gedestilleerd water. Na het aanpassen van de pH naar 7 met 1 M Tris-HCl, pH 9, vult u de oplossing tot 1 L met gedestilleerd water. De stockoplossing is lichtgevoelig en moet bij 4 °C in een amberkleurige fles worden bewaard. 2. Spier cryoinjury procedure Begin de procedure door de sonde minimaal 3 minuten onder te dompelen in vloeibare stikstof. Maak de spons nat in systeemwater en plaats hem op een vlakke ondergrond. Breng een enkele volwassen zebravis over in de Tricaine-werkoplossing en bevestig de niet-responsiviteit ervan door de vis na 1 minuut of 2 minuten zachtjes met de lepel aan te raken. Als de vis nog steeds reactief is, wacht dan nog even. Leg de verdoofde vis op de natte spons. Lokaliseer de caudale steel achter de anaalvin en vooraan bij de staartvin. Verwijder de cryoprobe uit de vloeibare stikstof. Schud de sonde voorzichtig om ervoor te zorgen dat er geen resterende vloeibare stikstof op de punt achterblijft. Plaats de rand van de spatel loodrecht op het lichaam op de caudale steel (figuur 1C). Houd de sonde 6 s in deze positie zonder druk uit te oefenen (figuur 1D).OPMERKING: Het gewicht van de cryoprobe is voldoende om contact tussen het instrument en het weefsel te garanderen. Laat de cryoprobe los uit het weefsel en breng de vis over in de tank met systeemwater. Controleer de vis terwijl hij weer ademt en zwemt na het ontwaken uit de anesthesie. Als operarculaire bewegingen na 30 s niet optreden, stimuleer de vis dan door systeemwater in de kieuwen te pipetteren totdat het dier zelf de ademhaling initieert.OPMERKING: De vis moet binnen enkele minuten weer zwemmen in de hersteltank.OPMERKING: In de volgende dagen kunnen de vissen worden gefilmd om hun zwemactiviteit te volgen (Video 1 en Video 2). Breng vóór de video-opname de controle en gewonde vissen over in een doorschijnende paringstank en laat ze minstens 1 minuut wennen. 3. Caudale steelverzameling en fixatie Bereid 2 ml 4% formaline of een ander fixeermiddel dat geschikt is voor de volgende testen, een petrischaal, een tang en een chirurgische schaar. Euthanaseer de vis op een geselecteerd tijdstip na de cryoinjury volgens de wettelijke toestemming van het regionale veterinaire kantoor.OPMERKING: Euthanasie wordt uitgevoerd door een overdosis tricaïne-oplossing (300 mg / L) gedurende ongeveer 10 minuten. Het verlies van kieuwbeweging en de staartvinknijpreflex bevestigt de dood. De tijdstippen van euthanasie moeten worden gekozen op basis van de fase van regeneratie: bijvoorbeeld van 1 dag na cryoletsel (dpci) tot 3 dpci voor wondklaring; van 3 dpci tot 10 dpci voor het initiëren van spierregeneratie; van 10 dpci tot 30 dpci voor voortschrijdende regeneratie; en na 30 dpci voor de voltooiing van weefselherstel. Om de verschillende stappen en biologische processen van spierdegeneratie en -regeneratie te beoordelen, moeten groepen vissen dus op verschillende tijdstippen na cryoletsel worden geëuthanaseerd. Leg de geëuthanaseerde vis in een petrischaaltje met gedeïoniseerd water. Gebruik een schaar om een knip door het lichaam vooraan en achter de caudale steel uit te voeren (figuur 1E). Laat het weefsel uitbloeden in het gedeïoniseerde water van de petrischaal. Verzamel de caudale steel en breng deze met een tang over in de bereide fixatieve oplossing in een microcentrifugebuis.OPMERKING: Keer de buizen voorzichtig meerdere keren om en bewaar ze een nacht bij 4 °C. 4. Montage van de caudale steel Was het vaste weefsel in 1x PBS gedurende 10 minuten op een wip. Breng het vervolgens over in een microcentrifugebuis van 2 ml met voorgekoelde 30% sucrose in gedeïoniseerd water bij 4 °C en keer de buis meerdere keren voorzichtig om. Laat de microcentrifugebuizen minimaal 24 uur bij 4 °C rechtop staan.OPMERKING: De caudale steel zal bovenop de sucrose-oplossing drijven en beginnen te zinken als het weefsel uitdroogt. Vul een inbeddingsvorm met een 5 mm laag O.C.T. montagemedium. Gebruik een tang om de caudale steel in het medium aan te passen. Plaats het aan de onderkant van de mal en pas de oriëntatie aan voor transversale of coronale secties (figuur 1F). Laat het medium invriezen in een doos droogijs. Zodra het weefsel in de gewenste positie is gestabiliseerd, vult u de rest van de mal op voordat de O.C.T. volledig bevriest. Bewaar de vorm minimaal 1 uur bij −80 °C.OPMERKING: Onder deze omstandigheden kunnen de weefsels vele maanden worden bewaard. 5. Snijd de secties met een cryostaat Zet een cryostaat op met een snijdikte van 25 μm. Stel de kamertemperatuur in op −26°C, de monstertemperatuur op −24°C en de snijhoek op 12°. Plaats het bevroren blok met het monster in de cryostaat en bevestig de oriëntatie om evenwijdig aan de onderkant van het blok te snijden. Knip totdat u het monster bereikt en snijd het blok vervolgens bij om de monsterverzameling te vergemakkelijken. Bereid zes hechtingsdia’s voor. Label de dia’s met opeenvolgende nummers om replica’s van het monster voor te bereiden. Begin met snijden en verzamel de weefselsecties op de gelabelde hechtingsglaasjes. Rangschik de secties op de dia’s volgens de verdere experimentele eisen. Laat de glaasjes 1 uur drogen bij kamertemperatuur. Bewaar ze in gesloten dozen bij −20 °C.OPMERKING: De dia’s kunnen tot 1 jaar veilig in deze staat worden bewaard.

Representative Results

Monitoring van de vis na cryoinjuryOm het effect van myomere cryoinjury op dieren te bepalen, werd een video-opname van controle- en cryogewonde vissen 1 dagen na cryoletsel (dpci) en 5 dpci uitgevoerd. Elke groep bevatte vijf vissen. Bij 1 dpci zwommen de gecryode vissen minder actief, maar ze vertoonden geen abnormale bewegingen, zoals werveling, convolutie of verminderd evenwicht (Video 1). In het houderijsysteem waren hun positie in de tank en voedselinname vergelijkbaar met die van de niet-gewonde vissen. Normaal gedrag bleef de volgende dagen bestaan, zoals geïllustreerd door de video op 5 dpci (Video 2). Kortom, de cryoinjury-procedure van de caudale steel had geen ernstige invloed op het welzijn van de dieren. Histologische analyse van de caudale steeldelenOm de omvang van het letsel te beoordelen, werd het tijdstip van 4 dpci geselecteerd, omdat dit is wanneer het myofiber-puin volledig in de wond is geresorbeerd. Om de effecten van cryoletsel langs de dorso-ventrale en voorste-achterste assen van het lichaam te analyseren, werden twee groepen vissen gebruikt (d.w.z. respectievelijk coronale en transversale secties van de caudale steel) (figuur 1F). De secties werden geanalyseerd door trichrome kleuring bestaande uit Aniline Blue, Acid Fuchsin en Orange G (AFOG). Met behulp van deze combinatie van reagentia werden intacte spieren in oranje getoond, het ruggenmerg in donkerrood en de collageenmatrix in blauw. Om het aantal beschadigde myomeren te bepalen, de metamere eenheden van de vismusculatuur, werd een reeks secties geanalyseerd (figuur 2). Myomeregrenzen, myocommata genaamd, werden geïdentificeerd door collageenafzetting, zoals gedetecteerd door blauwe kleuring. De beschadigde gebieden werden bepaald door de afwezigheid van oranje vlekken. Een nader onderzoek van exemplaren met duidelijke myocommata bracht aan het licht dat ongeveer vier opeenvolgende myomeren beschadigd waren, zoals afgeleid uit het ontbreken van oranje kleuring (n, aantal vissen = 4; Figuur 3A,A’). De ongedeerde kant van dezelfde vis diende als interne referentie. Om de diepte van de wond loodrecht op de lichaamsas te onderzoeken, werden transversale secties voorbereid met behulp van zebravissen bij 4 dpci en 7 dpci. Het laatste tijdstip komt overeen met de activering van het myogene programma en dus het begin van spierregeneratie. AFOG-kleuring van deze exemplaren vertoonde een uitgebreid gebrek aan oranje kleuring in de cryogewonde flank van het lichaam, waardoor de zone van gedegenereerde skeletspieren werd afgebakend (figuur 3B, C). Bij 4 dpci en 7 dpci overspande het wondgebied weefsels van de huid naar het verticale septum. Dit toont aan dat de cryoinjury-methode zich diep richtte op één laterale helft van de caudale steel, die gedurende 7 dagen na de procedure verstoken bleef van functionele spieren. Samen werden vier myomeren aan één kant van de staartsteel zwaar beschadigd. Immunofluorescentieanalyse van de transversale sectiesOm de dynamiek van spierregeneratie te beoordelen, werden experimentele groepen vissen geëuthanaseerd bij 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci en 30 dpci. De transversale secties van de caudale steel werden gelabeld door meerkleurige fluorescentiekleuring met behulp van falloïdine (dat bindt aan filamenteuze actine [F-actine]), tropomyosine-1-antilichaam, dat een sarcomeereiwit detecteert, en DAPI, dat kernen labelt. Op alle tijdstippen zorgde de niet-gewonde helft van het lichaam voor een interne controle; zowel F-actine als Tropomyosine 1 werden sterk gedetecteerd in de niet-gewonde controledelen, wat wijst op onbeschadigd weefsel (figuur 4). Bij 4 dpci bevatte de gewonde zijde van de caudale steel overvloedige DAPI-positieve cellen, maar er werd weinig tot geen F-actine en Tropomyosine 1 immunofluorescentie waargenomen, wat wijst op de wondzone met gedegenereerde spieren (figuur 4A-B’). Bij 7 dpci konden tropomysoë 1 en F-actine worden gedetecteerd in een deel van de wond dicht bij de verticale middellijn van het lichaam (figuur 4C-D’). Dit expressiepatroon bakent de positie af waar de vorming van nieuwe myofiberen begint in de caudale steel. Bij 10 dpci breidden beide spiermarkers zich uit naar het oppervlak van het lichaam, wat wijst op een voortschrijdende regeneratie van de skeletspieren (figuur 4E-F’). Bij 30 dpci vertoonden beide zijden van het lichaam een vergelijkbare verdeling van F-actinekleuring (figuur 4G-H’). Deze bevinding geeft aan dat de skeletspier efficiënt werd hersteld na de cryoinjury van de caudale steel. Figuur 1: Experimentele opstelling voor myomere cryoinjury. (A) Afmetingen van de op maat vervaardigde cryoprobe van roestvrij staal. Het distale deel van het instrument bestaat uit een spatel met een holle rand op een diepte van 1 mm om rekening te houden met de kromming van het zebravislichaam. Het middelste deel van het gereedschap bestaat uit een cilinder die functioneert als een gewicht en een reservoir om de lage temperatuur van de spatel tijdens de procedure te behouden. Het proximale uiteinde van het instrument heeft de vorm van een dun metalen handvat. (B,C) Verdoofde volwassen vis op een vochtige spons met de cryoprobe op de caudale steel. De sonde was op kamertemperatuur. (B) De rand van de sonde wordt horizontaal in de buurt van de staartsteel geplaatst om de relatieve grootte tussen de vis en het gereedschap weer te geven. (C) Voor cryoinjury wordt de punt van het gereedschap loodrecht op de vis geplaatst. (D) Schematische illustratie van de cryoinjuryprocedure vanaf de ventrale zijde van de vis om de manipulaties op een uitgebreide manier weer te geven. De cryoprobe werd voorgekoeld in vloeibare stikstof en onmiddellijk aan één kant van de vis geplaatst gedurende 6 s. (E) Op een specifiek tijdstip na cryoinjury werden de vissen geëuthanaseerd en hun caudale steeltjes werden verzameld voor fixatie. (F) Het vaste materiaal werd histologisch verwerkt en doorsneden langs de coronale of transversale vlakken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Histologische analyse van beschadigde myomeren in de caudale steel van de dorsale tot de ventrale positie van het lichaam. AFOG-kleuring van een reeks coronale secties 4 dagen na cryoletsel (dpci). De secties zijn van de dorsale naar de ventrale kant, zoals aangegeven op de bovenkant van het eerste en het laatste paneel. De secties zijn niet-aangrenzend, met een interval van ongeveer 150 μm ertussen. De niet-gewonde spier wordt gedetecteerd door oranje kleuring van de spier, terwijl het gewonde weefsel deze kleuring mist en grijsachtig lijkt (gebied omringd door een stippellijn). Collageenhoudende weefsels, zoals de huid, zijn blauw gekleurd. Het ruggenmerg verschijnt als een staafachtige structuur en is rood gekleurd. Aantal vissen, n = 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Beoordeling van de letseldiepte in de caudale steel met behulp van AFOG-kleuring. (A,A’) Het coronale gedeelte bevindt zich ter hoogte van het ruggenmerg (een rood gekleurde horizontale staaf). De onderste afbeelding toont een vergroot gebied met een kader in de bovenste afbeelding. De opeenvolgende myomeergrenzen verschijnen als collageenstrepen (blauw) schuin geplaatst ten opzichte van het ruggenmerg (rode pijlen in de uitvergrote afbeelding A’). (B,C) De doorsneden tonen de ongewonde flank met oranje gekleurde spieren en de cryogewonde flank met grijsachtige kleuring. Het beschadigde gebied is omgeven door een zwarte stippellijn. Het verticale septum (afgebeeld met een rode stippellijn) verdeelt het lichaam in de controle- en cryogewonde zijden. Aantal vissen, n = 4 per tijdpunt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Immunofluorescerende detectie van spiereiwitten na cryoletsel. Fluorescentiekleuring van doorsneden bij 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci en 30 dpci, zoals gelabeld aan de linkerkant en de bovenkant van de panelen (A-B’). Bij 4 dpci is het gewonde weefsel (omringd door de stippellijn) DAPI-positief (blauw) maar verstoken van falloïdinkleuring (groen) of tropomyosine-1 immunoreactiviteit (rood), wat duidt op degeneratie van de spiervezels na cryoletsel. (C-D’) Bij 7 dpci verschijnen beide spiermarkers progressief in het gewonde gebied, wat wijst op het regeneratieve proces. Tropomyosine-1 lijkt intenser dan F-actine in de nieuw gevormde vezels. (E-F’) Bij 10 dpci is de letselzone gevuld met nieuwe myofiberen die een hogere intensiteit van tropomyine-1 immunoreactiviteit vertonen in vergelijking met F-actine. (G-H’) Bij 30 dpci wordt een vergelijkbaar patroon van myofiberen gedetecteerd aan beide zijden van het lichaam. De kaders in de panelen A, C, E en H omvatten de gebieden die zijn vergroot in de aangrenzende afbeeldingen aan de rechterkant. Dermale schubben, die fluorescentie buiten de myomere uitstralen, werden met Adobe Photoshop uit de afbeeldingen gewist. Aantal vissen, n = 4 per tijdpunt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De zebravis levert een anamniote gewerveld modelorganisme om de mechanismen van spierregeneratie te bestuderen. De meeste van de bestaande letselmethoden, zoals laserablatie of steekwond, resulteren in relatief kleine weefselverstoring20,21,22,23. Grote resecties zijn uitgevoerd op extraoculaire spier26. Deze chirurgische aanpak zou echter waarschijnlijk minder geschikt zijn voor de laterale musculatuur vanwege de gezondheidsrisico’s van het snijden van de lichaamswand. Om dergelijke invasieve procedures te voorkomen, beschrijft dit protocol een mildere vorm van letsel die niettemin resulteert in ernstige schade aan de caudale steel. Deze benadering is gebaseerd op een oppervlakkige manipulatie die het mogelijk maakt om een paar myomeren aan één kant van het lichaam zeer nauwkeurig te richten. De sterke punten van het cryoinjury-model liggen in de reproduceerbaarheid en het vermogen om uitgebreide spierdegeneratie te produceren; Op basis van deze sterke punten biedt dit model een nieuw pad om te bestuderen hoe het lichaam reageert op aanzienlijk spierverlies.

De toepassing van extreme kou leidt tot een thermische schok, die het plasmamembraan en organellen in het aangetaste spierweefsel vernietigt27. Als gevolg hiervan ondergaan de gewonde myofiberen “toevallige” celdood28. Bijgevolg kan het beschadigde weefsel worden geresorbeerd door natuurlijke mechanismen van wondklaring. Zebravissen verdragen de cryoinjury-procedure goed, omdat de overlevingskans in deze studie bijna 100% was, aangezien de voorgekoelde sonde correct op het lichaam was geplaatst voor de exacte duur. Als de wond echter te uitgebreid is (bijvoorbeeld als er te veel druk wordt uitgeoefend of de duur van cryoletsel te lang is), kan de vis kort na de procedure afwijkende zwembewegingen vertonen en moet het dier worden geëuthanaseerd als een humaan eindpunt. Voor andere vissoorten moet de blootstellingstijd aan de cryoprobe worden aangepast aan de grootte van het lichaam.

Na cryoinjury kunnen de vissen hun zwemactiviteit hervatten zonder symptomen van abnormale beweging. Gecryoleerde vissen zwemmen echter minder dynamisch dan controlevissen, wat wijst op enkele milde beperkingen. Verdere kwantificering van het gedrag van de vis op verschillende tijdstippen na cryoletsel zal nodig zijn om temporele veranderingen in de zwemprestaties te bepalen.

Het effect van de cryoinjurymethode op andere niet-spierweefsels van de caudale steel moet nog worden opgehelderd. Het is duidelijk dat de buitenste lichaamslaag (d.w.z. de huid) wordt beschadigd door de procedure. In deze context kan de cryoinjury-methode een nieuwe strategie bieden om wondgenezing, schaalregeneratie en het herstel van het pigmentatiepatroon te bestuderen. Bovendien kunnen de vasculatuur en innervatie van de myomeren ook worden beïnvloed door cryoletsel, en deze onderwerpen vereisen verder onderzoek.

Het cryoinjury-model is eerder gebruikt om zebravishartregeneratie13,14,15,29 te onderzoeken. Deze methode toonde enkele voordelen ten opzichte van de ventriculaire resectiemethode10 vanwege de voorbijgaande afzetting van een collageenrijk litteken, dat de infarctgenezingsrespons bij mensen beter nabootst30. Opmerkelijk is dat zebravissen hun hart kunnen regenereren na meerdere cryoinjuries31. Interessant is dat cryoinjury ook is toegepast op de zebravisvin, wat resulteert in histolytische processen12. In tegenstelling tot de klassieke vinamputatie bevat de resterende cryogewonde stomp een vervormde marge met een mengsel van dood materiaal en gezonde cellen. Studies met beide zebravisorganen, het hart en de vin, hebben het krachtige vermogen van zebravissen aangetoond om hun oorspronkelijke functionele componenten te herstellen, zelfs na uitgebreide weefselschade. Of de cryogewonde skeletspier een samenspel tussen herstellende en regeneratieve processen activeert, rechtvaardigt toekomstige studies.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken V. Zimmermann voor de visverzorging, evenals Dr. Thomas Bise, Dr. Catherine Pfefferli en Lea Gigon voor de initiatie van dit project en hun voorlopige resultaten. Dit werk werd ondersteund door de Swiss National Science Foundation, subsidienummer 310030_208170.

Materials

Program
ImageJ National Institutes of Health (NIH)
Photoshop Version 23.5.3 Adobe
Material/ Equipment
35/10 mm Petri Dish Greiner Bio-one Item No.: 627102
Camera Sony / HDR-PJ410
Cryostat Histcom HRA C50
Formaldehyde ~36% Sigma-Aldrich 47630
Macro 50 mm f/2.8 EX DG lens Sigma / Discontinued lense
Peel-A-Way Embedding Truncated Molds T8 Polyscience, Inc. 18985
Slides Superfrost Plus Fisher Scientific 12-550-15
Sponge any any flat sponge, c.a. 7cm x 3 cm x 1 cm
Stainless steel cryoprobe Custom-made / specifics in the article
Sucrose Sigma-Aldrich 84100
Surgical scissors Any /
TCS SP2 Leica / Discontinoued product
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura Finetek 4583
Tricaine (Anestethic) Sigma E10521
Dyes and Antibodies
Dapi Sigma 10236276001 Concentration: 1/2000
Phalloidin-Atto-565 (F-actin) Sigma 94072 Concentration: 1 / 500
Tropomyosin (TPM1) DHSB CH1 Concentration: 1 / 50
Recipies/Solutions
1x PBS 123 mM NaCl Sigma
2.7 mM KCl Sigma
10 mM Na2HPO4 Sigma
1.8 mM KH2PO4 Sigma
AFOG solution 3 g Fuchsin Fisher Scientific
2 g Orange G Sigma
1 g Anilin blue Fulka AG
200 ml acifidied distilled H2O (pH 1.1)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. Mammalian regeneration and regenerative medicine. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 84 (4), 265-280 (2008).
  2. Carlson, B. M. Some principles of regeneration in mammalian systems. Anatomical Record. Part B, New Anatomist. 287 (1), 4-13 (2005).
  3. Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. -. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
  4. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
  5. Tulenko, F. J., Currie, P., Cartner, S. C. Zebrafish myology. The Zebrafish in Biomedical Research. , 115-121 (2020).
  6. Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell. The FEBS Journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).
  7. Corona, B. T., Wenke, J. C., Ward, C. L. Pathophysiology of volumetric muscle loss injury. Cells Tissues Organs. 202 (3-4), 180-188 (2016).
  8. Pfefferli, C., Jaźwińska, A. The art of fin regeneration in zebrafish. Regeneration. 2 (2), 72-83 (2015).
  9. Sehring, I. M., Weidinger, G. Recent advancements in understanding fin regeneration in zebrafish. WIREs Developmental Biology. 9 (1), 367 (2020).
  10. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  11. Sanz-Morejón, A., Mercader, N. Recent insights into zebrafish cardiac regeneration. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 37-43 (2020).
  12. Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage. Biology Open. 5 (6), 819-828 (2016).
  13. Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jaźwińska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Developmental Biology. 11, 21 (2011).
  14. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).
  15. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
  16. Ryan, R., Moyse, B. R., Richardson, R. J. Zebrafish cardiac regeneration-Looking beyond cardiomyocytes to a complex microenvironment. Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 533-548 (2020).
  17. Jaźwińska, A., Sallin, P. Regeneration versus scarring in vertebrate appendages and heart. Journal of Pathology. 238 (2), 233-246 (2016).
  18. Alexander, R. The orientation of muscle fibres in the myomeres of fishes. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 49, 163-290 (1969).
  19. Morin-Kensicki, E. M., Melancon, E., Eisen, J. S. Segmental relationship between somites and vertebral column in zebrafish. Development. 129 (16), 3851-3860 (2002).
  20. Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
  21. Montandon, M., Currie, P. D., Ruparelia, A. A. Examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62071 (2021).
  22. Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
  23. Ratnayake, D., et al. Macrophages provide a transient muscle stem cell niche via NAMPT secretion. Nature. 591 (7849), 281-287 (2021).
  24. Kaliya-Perumal, A. -. K., Ingham, P. W. Musculoskeletal regeneration: A zebrafish perspective. Biochimie. 196, 171-181 (2022).
  25. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2019).
  26. Saera-Vila, A., et al. Myocyte dedifferentiation drives extraocular muscle regeneration in adult zebrafish. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4977-4993 (2015).
  27. Baust, J. G., Gage, A. A. The molecular basis of cryosurgery. BJU International. 95 (9), 1187-1191 (2005).
  28. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
  29. Chablais, F., Jaźwińska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. Journal of Visualized Experiments. (62), e3666 (2012).
  30. Chablais, F., Jaźwińska, A. The regenerative capacity of the zebrafish heart is dependent on TGFbeta signaling. Development. 139 (11), 1921-1930 (2012).
  31. Bise, T., Sallin, P., Pfefferli, C., Jaźwińska, A. Multiple cryoinjuries modulate the efficiency of zebrafish heart regeneration. Scientific Reports. 10 (1), 11551 (2020).

Tags

ZebrafishCryoinjurySkeletal MuscleRegenerationCaudal PeduncleMyogenesisSatellite CellsHistologyFluorescence Staining

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Oudhoff, H., Baumgartner, F., Jaźwińska, A. A Cryoinjury Model for Studying Skeletal Muscle Regeneration of the Caudal Peduncle in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (197), e65491, doi:10.3791/65491 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image