نموذج الإصابة بالتبريد لدراسة تجديد العضلات الهيكلية للسويقة الذيلية في الزرد البالغ
Summary
يصف هذا البروتوكول نموذج الإصابة بالتبريد للحث على تلف عميق للعديد من الميومرات الذيلية في أسماك الزرد البالغة. توفر هذه الطريقة نهجا جديدا لدراسة تجديد العضلات والهيكل العظمي بعد الفقدان الشديد للأنسجة في الفقاريات غير الثديية.
Abstract
تخضع العضلات الهيكلية للتجديد والترميم بعد إصابة طفيفة من خلال تنشيط الخلايا الجذعية الشبيهة بالأقمار الصناعية. غالبا ما تؤدي الإصابات الشديدة في الجهاز العضلي إلى التليف عند البشر. بالمقارنة مع الثدييات ، تمتلك أسماك الزرد قدرة فطرية أعلى على تجديد الأعضاء ، مما يوفر نموذجا قويا لدراسة استعادة الأنسجة بعد الأضرار الجسيمة التي لحقت بالعضو. هنا ، تم وصف نموذج الإصابة بالتبريد لإحداث تلف عميق لأربعة عضل من السويقة الذيلية في الزرد البالغ. تم تصميم مسبار التبريد المصنوع خصيصا ليناسب شكل الجسم وإصابة العضلات الجانبية بشكل متكرر من الجلد إلى خط الوسط. الأهم من ذلك ، ظلت سلامة الجسم سليمة ، وواصلت الأسماك نشاط السباحة. تم تقييم التغييرات التي طرأت على العضلات الهيكلية عن طريق التلوين النسيجي وتلطيخ مضان البروتينات الساركومية على أقسام الأنسجة. ستفتح هذه الطريقة طرقا جديدة للبحث تهدف إلى فهم كيف يؤدي تنكس العضلات الهيكلية إلى استجابات تعويضية ، وبالتالي إعادة تنشيط البرنامج العضلي في الزرد البالغ.
Introduction
في الفقاريات ، تخضع الأجزاء التالفة من الأنسجة المختلفة لتجديد واستعادة الاستتباب خلال العمر. تعتمد هذه القدرة على التجديد والاستعادة عادة على وجود الخلايا الجذعية المختصة أو القدرة التكاثرية للخلايا الناضجة 1,2. تتكون العضلات الهيكلية من ألياف عضلية ما بعد الانقسام ، والتي ترتبط بالخلايا الجذعية المحلية ، تسمى الخلايا الساتلية3،4،5،6. وبالتالي ، يحتوي هذا النسيج على مصادر خلوية للإغلاق الفعال لمناطق الاستمرارية المتقطعة أو لإصلاح الجروح الطفيفة. ومع ذلك ، غالبا ما يتبع الخسائر الحجمية الأكبر في عضلات الهيكل العظمي للثدييات إصلاح غير متجدد ، مثل التليف7. يمكن أن توفر النماذج الحيوانية رؤى جديدة حول الآليات البيولوجية التي تعزز تجديد الأعضاء التالفة على نطاق واسع.
الزرد هو كائن نموذجي راسخ يتمتع بقدرة عالية على التجدد. يمكن لسمك الزرد البالغ تجديد جزء مبتور من الزعنفة الذيلية أو القمة المقطوعة للبطين القلبي8،9،10،11. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطبيق طريقة الإصابة بالتبريد سابقا لدراسة تجديد الزعانف والقلب في الزرد12،13،14،15. في حالة الأعضاء الداخلية ، تتمتع طريقة الإصابة بالتبريد بميزة إحداث موت الخلايا دون تعطيل سلامة الأعضاء ، وبالتالي محاكاة الظروف الفسيولوجية16,17. يتم تفكيك بقايا الأنسجة عن طريق الإزالة الطبيعية أثناء التئام الجروح ، تليها عمليات التعويض. ومع ذلك ، لا يزال يتعين تحديد ما إذا كان يمكن تطبيق هذه الطريقة على العضلات الهيكلية.
في الأسماك ، تتيح العضلات الجانبية ثني الجذع من جانب إلى آخر أثناء السباحة18. يتم تنظيم عضلات الهيكل العظمي في وحدات metameric ، تسمى myomeres ، والتي يتم فصلها بواسطة النسيج الضام 5,19. يمكن لسمك الزرد تجديد عضلاته بعد اضطرابات طفيفة في الأنسجة ، مثل تلك الناجمة عن الاستئصال بالليزر أو جرح الطعنة20،21،22،23،24 ، ولكن ما إذا كان يمكن أن يتجدد عضل كامل بعد إصابة واسعة النطاق لا يزال غير معروف. ربما ترجع هذه الفجوة في المعرفة إلى عدم وجود نموذج مناسب للإصابة. يؤسس هذا البروتوكول نهجا جديدا للحث على إصابة واسعة النطاق للعضلات الهيكلية ، تمتد عبر عضلات متعددة. تعتمد طريقة الإصابة بالتبريد الموصوفة على التجميد السريع وذوبان الألياف العضلية باستخدام أداة من الفولاذ المقاوم للصدأ مبردة مسبقا. على الرغم من الأضرار الجسيمة ، لم تتأثر رفاهية الأسماك بشدة. يمكن استعادة الميوميرات بأكملها ، وبالتالي ، يوفر هذا العمل نظاما نموذجيا جديدا لدراسة آليات تجديد العضلات في الزرد البالغ.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر الزرد كائنا نموذجيا للفقاريات لدراسة آليات تجديد العضلات. معظم طرق الإصابة الحالية ، مثل الاستئصال بالليزر أو جرح الطعنات ، تؤدي إلى اضطراب بسيط نسبيا في الأنسجة20،21،22،23. تم إجراء عمليات استئصال رئيسية على العضلات خارج العين26. ومع ذلك ، من المحتمل أن يكون هذا النهج الجراحي أقل ملاءمة للعضلات الجانبية بسبب المخاطر الصحية لقطع جدار الجسم. لتجنب مثل هذه الإجراءات الغازية ، يصف هذا البروتوكول شكلا أكثر اعتدالا من الإصابة التي ، مع ذلك ، تؤدي إلى أضرار جسيمة للسويقة الذيلية. يعتمد هذا النهج على التلاعب السطحي الذي يسمح بالاستهداف الدقيق للغاية لعدد قليل من العضل على جانب واحد من الجسم. تكمن نقاط القوة في نموذج الإصابة بالتبريد في قابليته للتكاثر وقدرته على إنتاج تنكس عضلي واسع النطاق. بناء على نقاط القوة هذه ، يوفر هذا النموذج مسارا جديدا لدراسة كيفية تفاعل الجسم مع فقدان العضلات بشكل كبير.
يؤدي تطبيق البرد الشديد إلى صدمة حرارية تدمر غشاء البلازما والعضيات في الأنسجة العضلية المصابة27. نتيجة لذلك ، تخضع الألياف العضلية المصابة لموت الخلايا “العرضي”28. وبالتالي ، يمكن امتصاص الأنسجة التالفة بواسطة الآليات الطبيعية لإزالة الجرح. يتحمل الزرد إجراء الإصابة بالتبريد جيدا ، حيث كان معدل البقاء على قيد الحياة في هذه الدراسة ما يقرب من 100٪ ، نظرا لأن المسبار المبرد مسبقا تم وضعه بشكل صحيح على الجسم طوال المدة المحددة. ومع ذلك ، إذا كان الجرح واسعا جدا (على سبيل المثال ، إذا تم تطبيق الكثير من الضغط أو كانت مدة الإصابة بالتبريد طويلة جدا) ، فقد تظهر الأسماك حركات سباحة شاذة بعد فترة وجيزة من الإجراء ، ويجب القتل الرحيم للحيوان كنقطة نهاية إنسانية. بالنسبة لأنواع الأسماك الأخرى ، يجب ضبط وقت التعرض للمسبار بالتبريد وفقا لحجم الجسم.
بعد الإصابة بالتبريد ، يمكن للأسماك استئناف نشاط السباحة دون أي أعراض لحركة غير طبيعية. ومع ذلك ، فإن الأسماك المصابة بالتبريد تسبح بشكل أقل ديناميكية من الأسماك الضابطة ، مما يشير إلى بعض الإعاقات الخفيفة. سيكون من الضروري إجراء مزيد من القياس الكمي لسلوك الأسماك في نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة بالتبريد لتحديد التغيرات الزمنية في أداء السباحة.
لا يزال يتعين توضيح تأثير طريقة الإصابة بالتبريد على الأنسجة غير العضلية الأخرى للسويقة الذيلية. من الواضح أن الطبقة الخارجية من الجسم (أي الجلد) تالفة بسبب الإجراء. في هذا السياق ، يمكن أن توفر طريقة الإصابة بالتبريد استراتيجية جديدة لدراسة التئام الجروح وتجديد القشور واستعادة نمط التصبغ. علاوة على ذلك ، يمكن أن تتأثر الأوعية الدموية وتعصيب العضل أيضا بالإصابة بالتبريد ، وتتطلب هذه الموضوعات مزيدا من التحقيق.
تم استخدام نموذج الإصابة بالتبريد سابقا للتحقيق في تجديد قلب الزرد13،14،15،29. أظهرت هذه الطريقة بعض المزايا مقارنة بطريقة استئصال البطين10 بسبب الترسب العابر لندبة غنية بالكولاجين ، والتي تحاكي بشكل أفضل استجابة الشفاء من الاحتشاء لدى البشر30. بشكل ملحوظ ، يمكن لسمك الزرد تجديد قلبه بعد إصابات التبريدالمتعددة 31. ومن المثير للاهتمام ، تم تطبيق الإصابة بالتبريد أيضا على زعنفة الزرد ، مما أدى إلى عمليات تحلل الأنسجة12. على عكس بتر الزعنفة الكلاسيكي ، يحتوي الجذع المتبقي المصاب بالتبريد على هامش مشوه بمزيج من المواد الميتة والخلايا السليمة. كشفت الدراسات التي أجريت على كل من أعضاء الزرد ، القلب والزعنفة ، عن القدرة القوية لسمك الزرد على استعادة مكوناتها الوظيفية الأصلية حتى بعد تلف الأنسجة على نطاق واسع. ما إذا كانت العضلات الهيكلية المصابة بالتبريد تنشط التفاعل بين العمليات التعويضية والتجديدية تستدعي دراسات مستقبلية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر V. Zimmermann على رعاية الأسماك ، وكذلك الدكتور توماس بيز ، والدكتورة كاثرين فيفرلي ، وليا جيجون على بدء هذا المشروع ونتائجهم الأولية. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم ، رقم المنحة 310030_208170.
Materials
| Program | |||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Photoshop Version 23.5.3 | Adobe | ||
| Material/ Equipment | |||
| 35/10 mm Petri Dish | Greiner Bio-one | Item No.: 627102 | |
| Camera | Sony | / | HDR-PJ410 |
| Cryostat | Histcom | HRA C50 | |
| Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 | |
| Macro 50 mm f/2.8 EX DG lens | Sigma | / | Discontinued lense |
| Peel-A-Way Embedding Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 | |
| Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sponge | any | any | flat sponge, c.a. 7cm x 3 cm x 1 cm |
| Stainless steel cryoprobe | Custom-made | / | specifics in the article |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Surgical scissors | Any | / | |
| TCS SP2 | Leica | / | Discontinoued product |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 | |
| Dyes and Antibodies | |||
| Dapi | Sigma | 10236276001 | Concentration: 1/2000 |
| Phalloidin-Atto-565 (F-actin) | Sigma | 94072 | Concentration: 1 / 500 |
| Tropomyosin (TPM1) | DHSB | CH1 | Concentration: 1 / 50 |
| Recipies/Solutions | |||
| 1x PBS | 123 mM NaCl | Sigma | |
| 2.7 mM KCl | Sigma | ||
| 10 mM Na2HPO4 | Sigma | ||
| 1.8 mM KH2PO4 | Sigma | ||
| AFOG solution | 3 g Fuchsin | Fisher Scientific | |
| 2 g Orange G | Sigma | ||
| 1 g Anilin blue | Fulka AG | ||
| 200 ml acifidied distilled H2O (pH 1.1) |
References
- Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. Mammalian regeneration and regenerative medicine. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 84 (4), 265-280 (2008).
- Carlson, B. M. Some principles of regeneration in mammalian systems. Anatomical Record. Part B, New Anatomist. 287 (1), 4-13 (2005).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. -. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Tulenko, F. J., Currie, P., Cartner, S. C. Zebrafish myology. The Zebrafish in Biomedical Research. , 115-121 (2020).
- Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell. The FEBS Journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).
- Corona, B. T., Wenke, J. C., Ward, C. L. Pathophysiology of volumetric muscle loss injury. Cells Tissues Organs. 202 (3-4), 180-188 (2016).
- Pfefferli, C., Jaźwińska, A. The art of fin regeneration in zebrafish. Regeneration. 2 (2), 72-83 (2015).
- Sehring, I. M., Weidinger, G. Recent advancements in understanding fin regeneration in zebrafish. WIREs Developmental Biology. 9 (1), 367 (2020).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Sanz-Morejón, A., Mercader, N. Recent insights into zebrafish cardiac regeneration. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 37-43 (2020).
- Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage. Biology Open. 5 (6), 819-828 (2016).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jaźwińska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Developmental Biology. 11, 21 (2011).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Ryan, R., Moyse, B. R., Richardson, R. J. Zebrafish cardiac regeneration-Looking beyond cardiomyocytes to a complex microenvironment. Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 533-548 (2020).
- Jaźwińska, A., Sallin, P. Regeneration versus scarring in vertebrate appendages and heart. Journal of Pathology. 238 (2), 233-246 (2016).
- Alexander, R. The orientation of muscle fibres in the myomeres of fishes. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 49, 163-290 (1969).
- Morin-Kensicki, E. M., Melancon, E., Eisen, J. S. Segmental relationship between somites and vertebral column in zebrafish. Development. 129 (16), 3851-3860 (2002).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
- Montandon, M., Currie, P. D., Ruparelia, A. A. Examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62071 (2021).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Ratnayake, D., et al. Macrophages provide a transient muscle stem cell niche via NAMPT secretion. Nature. 591 (7849), 281-287 (2021).
- Kaliya-Perumal, A. -. K., Ingham, P. W. Musculoskeletal regeneration: A zebrafish perspective. Biochimie. 196, 171-181 (2022).
- Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2019).
- Saera-Vila, A., et al. Myocyte dedifferentiation drives extraocular muscle regeneration in adult zebrafish. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4977-4993 (2015).
- Baust, J. G., Gage, A. A. The molecular basis of cryosurgery. BJU International. 95 (9), 1187-1191 (2005).
- Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
- Chablais, F., Jaźwińska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. Journal of Visualized Experiments. (62), e3666 (2012).
- Chablais, F., Jaźwińska, A. The regenerative capacity of the zebrafish heart is dependent on TGFbeta signaling. Development. 139 (11), 1921-1930 (2012).
- Bise, T., Sallin, P., Pfefferli, C., Jaźwińska, A. Multiple cryoinjuries modulate the efficiency of zebrafish heart regeneration. Scientific Reports. 10 (1), 11551 (2020).
