脱細胞化による骨格筋脂肪浸潤の定量化

マウスの飼育と犠牲は、国立衛生研究所の実験動物の使用と飼育に関するガイドに従って行われました。すべての研究は、ワシントン大学セントルイス医科大学の動物研究委員会によって承認されました。生後2〜3ヶ月の雄のC57BL/6Jマウス( 材料表を参照)を使用して、このプロトコルに含まれるサンプル画像を生成しました。以下に説明するすべてのステップは、室温で実行されます。 1.筋肉の脱細胞化 リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に1%w/vドデシル硫酸ナトリウム(SDS; 材料表を参照)溶液を調製します。完全に混ざるまで溶液をかき混ぜます。注:1%SDSはまとめて調製し、室温で1か月間保存できます。 前述のように、目的の筋肉を解剖します38,39。70%エタノール溶液で髪と皮膚を濡らし、約2cmの経皮的切開を行った後、鉗子とスプリングハサミで覆っている皮膚を取り除きます。注:ここで関心のある筋肉には、前脛骨筋(TA)、長指伸筋(EDL)、および横隔膜が含まれます。一部の筋肉は他の筋肉組織の奥深くにあり、他の筋肉の解剖を必要とする場合があります(たとえば、EDLを解剖するにはTAの除去が必要です)。 鋭利なハサミまたはブレード( 材料表を参照)を使用して目的の筋肉を解剖し、筋肉の全範囲が得られ、エッジが滑らかであることを確認します。注:これは、視覚化を改善するために、解剖顕微鏡の下で行うのが理想的です。 筋肉を点検して、骨の欠けや不揃いのエッジが含まれていないことを確認してから、必要に応じて鋭利なハサミでこれらを切り取ります。 分析天びんを使用して筋肉の重量を量り、重量を記録します。 解剖した筋肉を、重量1ミリグラムあたり少なくとも0.1mLの1%SDSに入れます。6ウェル、12ウェル、または24ウェルプレートは、それぞれ横隔膜、TA、およびEDLマウスの筋肉に適しています。一般的な容量は、6 mL、12 mL、24 ウェルプレートでそれぞれ 6 mL、3 mL、1.5 mL です。注:SDS溶液は筋肉を変形させることがあるので、最初の浸漬時に筋肉が平ら/伸びていることを確認してください。 ウェルプレート(または他の容器)を50〜80Hzに設定されたロッキングシェーカーに置きます。 SDS溶液を定期的に目視検査します。溶液が濁ったら、ピペットで溶液を取り除き(筋肉を吸引しないように注意して)、等量の新鮮な1%SDSと交換します。溶液が24時間透明なままになると、脱細胞化が完了します。注:溶液交換に必要な頻度は、筋肉のサイズと初期溶液量によって異なります。TAのような大きな筋肉は数時間以内に新しいSDSを必要とし、EDLのような小さな筋肉は元の溶液で一晩中過ごすことができます。 脱細胞化した筋肉から最終的なSDS溶液をピペットで除去し(筋肉を誤嚥しないように注意して)、等量のPBSと交換します。 解剖顕微鏡で脱細胞化した筋肉を目視検査し、鉗子とハサミを使用して筋肉に付着した髪の毛や破片を取り除きます。注:また、このステップでは、脱細胞化筋肉の明瞭さにも注意してください。脱細胞化した筋肉が完全に透明ではなく、SDS溶液が24時間にわたって曇りが増加しない場合、脱細胞化は効率的ではありませんでした。これにより、定性的および定量的評価にアーティファクトが作成されるため、実験筋に進む前に、常に練習用サンプルで脱細胞化を最適化する必要があります。 PBSを慎重に取り出し、等量の3.7%ホルムアルデヒドまたは4%パラホルムアルデヒド溶液と交換し、プレートをロッキングシェーカーに24時間戻します。注:ホルムアルデヒド溶液が脱細胞化した筋肉を完全に覆っていることを確認してください、そうでなければ染色は不均一になります。 2. オイルレッドOによるIMATの可視化 OROの溶液を調製する。0.5 gのORO粉末( 材料表を参照)を100 mLのイソプロパノールに溶解して、ストック溶液を生成します。注意: 溶液に穏やかな熱を加えて完全に溶かします。このストックは室温で1ヶ月間保存できます。 OROストック溶液と脱イオン水を60:40の比率で組み合わせて、少なくとも0.1 mL / mgの筋肉重量の容量を使用して、すべての筋肉に必要な作業溶液を取得します。一般的な容量は、6 mL、12 mL、24 ウェルプレートでそれぞれ 6 mL、3 mL、1.5 mL です。注意: 混合する前に原液を検査してください。原液に大量の微粒子が含まれている場合は、新鮮なストックを作ります。 作業溶液を10分間覆い、微粒子を沈殿させます。 40 μmメッシュで作業溶液をろ過し、続いて0.22 μmシリンジフィルターでろ過します。注:0.22 μmのシリンジフィルターは急速に目詰まりするため、作業溶液が簡単に押し出されない場合は交換する必要があります。 ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒド溶液を除去し、等量のPBSの3回の溶液交換で脱細胞化した筋肉を洗浄します。 PBSを等量の60%イソプロパノール溶液と交換し、ロッキングシェーカーで5分間インキュベートします。 60%イソプロパノール溶液をOROワーキング溶液と交換し、ロッキングシェーカーで10分間インキュベートします。注:OROワーキング溶液が脱細胞化筋肉を完全に覆っていることを確認してください、そうでなければ染色は不均一になります。 ORO作業溶液を等量の1%SDSと交換します。SDS溶液を定期的に目視検査します。溶液が著しくピンク色になったら、ピペットで溶液を取り除き(筋肉を吸引しないように注意して)、新しい1%SDSと交換します。 溶液が24時間透明のままになったら、1%SDSをPBSに交換し、4倍の倍率で解剖/実体顕微鏡で染色された筋肉を検査します。筋肉の外側に付着している明らかな破片や微粒子を取り除きます。これが広範囲にわたる場合は、脱細胞化した筋肉を洗浄組織上で優しく転がして、破片/微粒子を剥がすことができます。 染色が満足のいくものであれば(透明なマトリックスに真っ赤な球体が浮かんでいる)、実体顕微鏡に取り付けたカメラを使用して、必要に応じて染色の画像を取得します( 材料表を参照)。注意: 解剖顕微鏡にカメラが取り付けられていない場合は、電話のカメラを使用して接眼レンズを通して写真を撮ることができます。 3. BODIPYによるIMAT脂質滴の可視化 注:共焦点イメージングは、EDLや横隔膜(~2mmの厚さ)のような薄い筋肉で最も効果的です。あるいは、TAのような同等の厚さの筋肉のストリップを使用することもできます。 PBSで蛍光BODIPY 493/503( 材料表を参照)の1:200溶液を調製して、少なくとも0.1 mL / mgの筋肉重量の作業溶液量を取得します。一般的な容量は、6 mL、12 mL、24 ウェルプレートでそれぞれ 6 mL、3 mL、1.5 mL です。 ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、または1%SDSを除去し、同量のPBSを3回交換して脱細胞化した筋肉を洗浄します。 PBSをBODIPYワーキング溶液と交換し、ロッキングシェーカーで20分間インキュベートします。 脱細胞化した筋肉を、等量のPBSの3回の溶液交換で洗浄します。 利用可能な共焦点顕微鏡と互換性のある透明な底の血管に筋肉を置きます。理想的には、皿の底が凹んでいて、筋肉を変形させることなくカバースリップを筋肉の上に配置します( 材料表を参照)。 488レーザーを使用して、標準的な共焦点顕微鏡( 材料表を参照)で画像スタックを取得します。EDLの一般的なスタックサイズは0.5〜1mmで、スライスの厚さは10μmで、スタックあたり50〜100枚の画像が得られます。注:総脂質体積、IMAT脂質滴の総数、およびクラスタリングの最近傍指数を定量化するには、画像登録のために重複を残すように注意しながら、筋肉体積全体を画像化します。平均脂質液滴量を定量化するには、1スタックで十分です。 必要に応じて、セクション2に従って筋肉をOROで染色し、IMAT分布の筋肉全体の画像を補完します。注:BODIPYは蛍光性であるため、OROの画像を取得すると、光学顕微鏡では見えません。 4. 脂質抽出による総脂質量の推定 画像取得後、筋肉を 96 ウェルプレートの個々のウェルで 200 μL のイソプロパノールに移すか、筋肉が大きすぎて収まらない場合はウェル/容量を調整します。 プレートを軽くたたくか、溶液を上下にピペッティングするか、ピペットチップで筋肉を機械的に押しつぶして、顕微鏡で脱細胞化した筋肉に赤/蛍光球が見えなくなるまで、溶液を攪拌します。注:最高の信頼性を得るために、すべての筋肉をタッピング、ピペッティング、および破砕の同じ組み合わせで処理します。また、イソプロパノールは急速に蒸発するため、タッピング、ピペッティング、破砕に費やす時間を制限するように注意してください。 ピペッティングで上下させて各ウェルで溶液を混合し、75 μLをプレートの2つのクリーンウェルに移します。 プレートを覆い、分光光度計またはプレートリーダーを使用して、複製された75 μLウェルの吸光度を読み取ります。コンストラクトをOROで染色した場合は、溶液を500 nmで読み取ります。BODIPY 493/503で染色した場合は、プレートを493 nmで読み取ります。注:コンストラクトをBODIPYとOROの両方で染色した場合、500 nmのリードでは、OROのみで染色したコンストラクトとOROとBODIPYで染色したコンストラクトの間で同様の結果が得られるため、プレートを500 nmで読み取ることをお勧めします。 必要に応じて、吸光度の読み取り値を記録された筋肉の重量で割り、サンプル間のサイズの違いを補正します。 5. 共焦点画像からのIMAT脂質滴指標の定量化 注: このセクションでは、ImageJ バージョン 1.47 ( 資料表を参照) 以降と ImageJ の基本スキル40 へのアクセスが必要です。 ImageJ で共焦点スタックを開きます。注:共焦点顕微鏡が異なれば、共焦点画像を異なる形式で保存できる場合があります。ImageJは、スタック41を開くために、フィジーなどの追加のプラグインまたはバリアントを必要とし得る。使用されるアルゴリズムは、ImageJ ソフトウェア・パッケージの一部です。 ImageJ でしきい値処理アルゴリズムを実行して、BODIPY 正のピクセルを特定します。これにより、現在のイメージがバイナリ イメージに変換されます。「イメージ」>「>しきい値の調整」を選択して、しきい値ユーザーインターフェイスを開きます。ユーザー インターフェイスで、しきい値設定タイプとして [Intermodes] を選択し、[Dark background] が選択されていることを確認します。他のオプションを選択する必要はありません。次に、[適用]をクリックします。 スタックをバイナリに変換するためのダイアログボックスが開きます。次のオプションが選択されていることを確認します。 メソッド:インターモード。背景:暗い。各画像と黒の背景(バイナリマスクの)のしきい値を計算します。これにより、白はBODIPYの正のピクセルを示し、黒はBODIPYの負のピクセルを示すバイナリスタックが生成されます。メモ: インターモードしきい値 処理アルゴリズムは、すべてのユーザーにとって最適な選択ではない場合があります。ImageJ に組み込まれている閾値処理オプションの主観的な検査は、BODIPY の正のピクセルと負のピクセルを分離するための最適なアルゴリズムを選択するのに役立ちます。 ImageJ で Watershed アルゴリズムを実行して、接触する脂質滴を分離します。[ Process > Binary > Watershed] を選択します。ダイアログボックスが開き、スタック内のすべての画像を処理するかどうかを尋ねられます。[ はい] を選択します。これにより、白一色の広い領域を分割する細い黒い線が追加されます。 ImageJ の粒子分析アルゴリズムを使用して ROI を特定します。[解析]>[パーティクルを解析]を選択します。選択設定を行うためのダイアログボックスが開きます。注:脂質滴 ROI の最適な推定値を得るためには、サイズ範囲の選択が重要です。下限は、IMAT由来の脂質滴(バックグラウンドアーチファクト)としては小さすぎる可能性が高い領域を除外し、上限は、単一のIMAT由来の脂質滴(Watershedアルゴリズムによって分離されなかった接触脂質滴)には大きすぎる可能性が高い領域を除外します。 これらの値を設定するには、元の画像を開き、楕円ツールを使用して、ビュー内の最小および最大の脂質滴の輪郭を描きます。次に、これらの図形を “t” と入力して ROI マネージャーに追加します。 [分析] を選択し、 次に [測定値の設定] を選択します。設定を選択するためのダイアログボックスが開きます。[Area only] をオンにして [OK] をクリックします。次に、ROIマネージャーから[測定]を選択します。この結果ウィンドウの 2 つの面積メジャーを、パーティクルの解析(Analyze Particles)のサイズ範囲として使用します。 [ マネージャに追加(Add to Manager )] がオンになっていることを確認します。他のオプションは必要ありません。 ROI マネージャーで [ すべて表示 ] をオンにして、共焦点スタックに ROI をオーバーレイします。スライダーバーを使用して各スタックスライスを個別に検査し、楕円ツール(ImageJツールバーにあります)を使用して欠落している領域を手作業で追加します。 ROI 測定値を出力します。 「分析」>「測定値を設定 」を選択し、「 面積」、「重心」、「楕円のフィット 」、および 「スタック位置」を選択します。[ OK]をクリックします。次に、ROIマネージャーから [測定 ]を選択します。結果テーブルのデータを選択し、MatlabまたはExcelにコピーしてさらに分析することができます。 Refine.m Matlab コード37 または同様のアルゴリズムを使用して、各スタックの ROI を 1 つの ROI に調整します。注:このステップは、ステップ5.2〜5.4が隣接するスライス内の同じ脂質滴を異なるROIとして識別するために必要です。ただし、ROIを手作業のみで識別したり、ImageJで重複するROIを手作業で削除したりして、Matlabの必要性を回避することもできます。 MATLAB または Excel を使用して ROI の要約統計量を取得します。脂質液滴の総数を ROI の総数として推定します。 形状の深さが楕円の長軸と短軸の平均であると仮定して、各 2D ROI に適合した楕円の体積として脂質液滴の体積を推定します。 個々の推定脂質滴量の合計である総脂質量を推定します。