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Biology

Dezellularisierungsbasierte Quantifizierung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur

Published: June 09, 2023
doi:
10.3791/65461
, ,
1Program in Physical Therapy,Washington University in St. Louis, 2Departments of Neurology, Orthopaedic Surgery and Biomedical Engineering,Washington University in St. Louis

Summary

Die vorliegende Studie beschreibt dezellularisierungsbasierte Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung der Ablagerung von intramuskulärem Fettgewebe (IMAT) durch intaktes Muskelvolumen sowie zur Quantifizierung von Metriken einzelner Adipozyten, aus denen IMAT besteht.

Abstract

Fettinfiltration ist die Ansammlung von Adipozyten zwischen den Myofasern in der Skelettmuskulatur und ist ein herausragendes Merkmal vieler Myopathien, Stoffwechselstörungen und Dystrophien. Klinisch wird die Fettinfiltration in menschlichen Populationen mit nicht-invasiven Methoden wie Computertomographie (CT), Magnetresonanztomographie (MRT) und Ultraschall (US) beurteilt. Obwohl einige Studien CT oder MRT verwendet haben, um die Fettinfiltration im Mausmuskel zu quantifizieren, bleiben die Kosten und die unzureichende räumliche Auflösung eine Herausforderung. Andere Kleintiermethoden nutzen die Histologie, um einzelne Adipozyten sichtbar zu machen. Diese Methodik leidet jedoch unter einer Stichprobenverzerrung in der heterogenen Pathologie. Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur qualitativen Betrachtung und quantitativen Messung der Fettinfiltration im gesamten intakten Mausmuskel und auf der Ebene einzelner Adipozyten mittels Dezellularisierung. Das Protokoll ist nicht auf bestimmte Muskeln oder bestimmte Spezies beschränkt und kann auf die menschliche Biopsie ausgeweitet werden. Darüber hinaus können qualitative und quantitative Bruttobewertungen mit Standard-Laborgeräten zu geringen Kosten durchgeführt werden, wodurch dieses Verfahren in allen Forschungslabors leichter zugänglich wird.

Introduction

Die Anhäufung von Adipozyten zwischen den Myofasern innerhalb des Skelettmuskels ist ein herausragendes Merkmal unterschiedlicher Erkrankungen, von Typ-2-Diabetes über Sarkopenie bis hin zu Muskel-Skelett-Verletzungen 1,2,3,4,5,6,7. Eine umfassende Beurteilung dieses intramuskulären Fettgewebes (IMAT) ist entscheidend für das Verständnis der Pathogenese dieser Erkrankungen, da die IMAT-Ablagerung stark mit einer Insulinresistenz korreliert 3,8,9,10 und einer schlechten Skelettmuskelfunktion 11,12,13,14,15 . Obwohl diese Zusammenhänge seit Jahrzehnten beobachtet werden, sind die Mechanismen, die mit IMAT verbunden sind, und der Ursprung von IMAT immer noch Gegenstand intensiver Untersuchungen. Dies liegt zum Teil daran, dass die meisten Studien, die die Fettinfiltration der Skelettmuskulatur untersuchen, beim Menschen durchgeführt wurden, wo die mechanistischen Untersuchungen begrenzt sind16,17. In jüngster Zeit wurden jedoch Kleintiermodelle, einschließlich Mäuse, verwendet, um die zelluläre Regulation der IMAT-Entwicklung und -Signalübertragung zu bestimmen18,19,20. Ziel dieser Arbeit ist es, ein neues Werkzeug für den Einsatz mit Kleintiermodellen zur qualitativen Visualisierung und Quantifizierung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur bereitzustellen.

Klinisch wird die Fettinfiltration in menschlichen Populationen mit nicht-invasiven Methoden beurteilt, einschließlich Computertomographie (CT)6,21, Magnetresonanztomographie (MRT)16,17,22,23 und Ultraschall (US)17,24. Diese bildgebenden Verfahren identifizieren in der Regel eine definierte Region of Interest (ROI) in einem Muskel und erfassen Bildschnitte innerhalb dieser Region, obwohl auch umfassende Ansätze verwendet wurden25,26,27. Diese Bildausschnitte werden einer qualitativen Abstufung6 unterzogen und über die Pixelschwelle28 quantifiziert. Ähnliche Ansätze wurden zuvor bei Tieren angewendet29,30; Sie sind jedoch kostspielig und erfordern den Zugang zu bildgebenden Systemen für Kleintiere. Die räumliche Auflösung mittels CT und MRT stellt ebenfalls ein großes Problem dar, da sie nicht in der Lage sind, IMAT-Adipozyten von Skelettmuskelfasern innerhalb eines Voxels abzugrenzen, sondern sich stattdessen auf die subjektive Trennung von primär Muskelregionen und primär IMAT-Regionen verlassen31,32. Daher stellt die Unfähigkeit, Fett- oder Muskelgewebe genau zu identifizieren, auch eine ungenaue Quantifizierung repräsentativer Mengen dieser Gewebe dar.

Aufgrund dieser Einschränkungen stützen sich die derzeitigen Techniken zur Beurteilung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur in Kleintiermodellen am häufigsten auf die Histologie als kostengünstige und zugängliche Alternative33,34. Standard-Färbeverfahren, einschließlich Hämatoxylin und Eosin (H&E), Ölrot O (ORO) und Immunfärbung für Adipozytenmarker wie Perilipin, ermöglichen den einfachen Nachweis und die Visualisierung von Adipozyten, die eine Fettinfiltration im Muskel aufweisen. Histologische Ansätze sind jedoch selten umfassend, und in der Regel ist die qualitative oder quantitative IMAT-Beurteilung auf einen einzigen Abschnitt34 beschränkt. Die Lipidextraktion wurde auch zur Quantifizierung der gesamten Muskellipide verwendet35; Diese Technik unterscheidet jedoch nicht zwischen intramyozellulären Lipidspeichern (IMCL) und intramuskulären Fettgewebespeichern (IMAT)36. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die derzeitigen Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung von Muskelfett entweder durch finanzielle Kosten oder den spezifischen Nachweis von IMAT begrenzt bleiben.

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Beurteilung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur sowohl durch qualitative Visualisierung als auch durch Multiskalen-Quantifizierung. Diese Methode verwendet eine einfache Dezellularisierungstechnik, bei der myozelluläre Strukturen, einschließlich IMCL, entfernt werden, aber die größeren, von IMAT-Adipozyten abgeleiteten Lipidtröpfchen intakt bleiben. Die Validierung der Spezifität dieser Technik wurde veröffentlicht37, einschließlich der Verwendung von Lipidextraktion, um die Depletion von IMCL mit Dezellularisierung zu zeigen, μCT, um die Beibehaltung von IMAT-Mustern bei Dezellularisierung zu zeigen, und Histologie, um die ähnliche Größenverteilung von IMAT-Lipidtröpfchen im Vergleich zu denen, die mit Dezellularisierung identifiziert wurden, zu zeigen. Nach der Dezellularisierung können die Muskeln mit fettlöslichen Farbstoffen gefärbt werden, um das Muster und das Ausmaß der Fettinfiltration und/oder die quantitative Bildgebung einzelner IMAT-Lipidtröpfchen qualitativ sichtbar zu machen. Farbstoffe können anschließend mit Isopropanol extrahiert werden, und die optische Dichte (OD) der resultierenden Lösung kann zur Abschätzung des IMAT-Lipidvolumens verwendet werden. Die stringente Validierung dieser Technik wurde an anderer Stelle veröffentlicht37. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die Verwendung dieser Methode mit Mausmuskeln und Tipps zur Fehlerbehebung, um die Einführung dieser Methode in anderen Anwendungen zu unterstützen, z. B. Muskeln anderer Spezies oder anderer Gewebe.

Protocol

Die Pflege und Opferung der Mäuse erfolgte in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Use and Care of Laboratory Animals. Alle Arbeiten wurden vom Animal Studies Committee der Washington University in der St. Louis School of Medicine genehmigt. Männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 2-3 Monaten (siehe Materialtabelle) wurden verwendet, um die in diesem Protokoll enthaltenen Beispielbilder zu erzeugen. Alle im Folgenden beschriebenen Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt. 1. Dezellularisierung der Muskeln Bereiten Sie eine 1%ige Gew.-Lösung Natriumdodecylsulfat (SDS; siehe Materialtabelle) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor. Rühren Sie die Lösung, bis sie vollständig vermischt ist.HINWEIS: 1% SDS kann in loser Schüttung zubereitet und 1 Monat lang bei Raumtemperatur gelagert werden. Sezieren Sie den/die interessierenden(n) Muskel(n) wie zuvor beschrieben38,39.Legen Sie die interessierenden Muskeln frei, indem Sie das Haar und die Haut mit 70%iger Ethanollösung benetzen und dann einen transkutanen Schnitt von ca. 2 cm machen, gefolgt von der Entfernung der bedeckenden Haut mit einer Zange und einer Federschere.HINWEIS: Zu den Muskeln, die hier von Interesse sind, gehören der Tibialis anterior (TA), der Extensor digitorum longus (EDL) und das Zwerchfell. Einige Muskeln können tief in einer anderen Muskulatur liegen und eine Dissektion anderer Muskeln erfordern (z. B. erfordert die Dissektion des EDL die Entfernung des TA). Sezieren Sie den/die interessierende(n) Muskel(n) mit einer scharfen Schere oder Klinge (siehe Materialtabelle), um sicherzustellen, dass die gesamte Ausdehnung des Muskels erhalten bleibt und die Kanten glatt sind.HINWEIS: Dies wird idealerweise unter einem Präpariermikroskop durchgeführt, um die Visualisierung zu verbessern. Untersuche die Muskeln, um sicherzustellen, dass keine Knochensplitter oder ausgefranste Kanten enthalten sind, und schneide diese dann bei Bedarf mit einer scharfen Schere ab. Wiegen Sie den Muskel mit einer Analysenwaage und notieren Sie das Gewicht. Legen Sie den präparierten Muskel in mindestens 0,1 ml 1% SDS pro Milligramm Körpergewicht; 6-, 12- oder 24-Well-Platten eignen sich gut für die Zwerchfell-, TA- bzw. EDL-Mausmuskeln. Typische Volumina sind 6 ml, 3 ml und 1,5 ml für 6-, 12- bzw. 24-Well-Platten.HINWEIS: Die SDS-Lösung führt manchmal dazu, dass sich die Muskeln verformen, also stellen Sie sicher, dass der Muskel beim ersten Eintauchen flach/gestreckt ist. Stellen Sie die Well-Platte (oder andere Gefäße) auf einen Schaukelschüttler, der auf 50-80 Hz eingestellt ist. Überprüfen Sie die SDB-Lösung in regelmäßigen Abständen visuell. Wenn die Lösung trüb wird, entfernen Sie die Lösung mit einer Pipette (achten Sie darauf, den Muskel nicht abzusaugen) und ersetzen Sie sie durch ein gleiches Volumen frischer 1%iger SDS. Wenn die Lösung 24 Stunden lang klar bleibt, ist die Dezellularisierung abgeschlossen.HINWEIS: Die Häufigkeit, die für Lösungswechsel erforderlich ist, variiert je nach Muskelgröße und dem anfänglichen Lösungsvolumen. Größere Muskeln wie der TA benötigen innerhalb weniger Stunden ein neues SDS, und kleinere Muskeln wie der EDL können über Nacht in der ursprünglichen Lösung verschwinden. Entfernen Sie die endgültige SDS-Lösung mit einer Pipette aus den dezellularisierten Muskeln (achten Sie darauf, den Muskel nicht abzusaugen) und ersetzen Sie sie durch ein gleiches Volumen PBS. Untersuchen Sie die dezellularisierten Muskeln visuell unter einem Präpariermikroskop und entfernen Sie mit einer Pinzette und einer Schere alle Haare oder Ablagerungen, die am Muskel haften.HINWEIS: Beachten Sie auch die Klarheit des dezellularisierten Muskels in diesem Schritt. Wenn der dezellularisierte Muskel nicht vollständig transparent ist und die SDS-Lösung über 24 h nicht an Trübung zunimmt, dann war die Dezellularisierung nicht effizient. Dies führt zu einem Artefakt in qualitativen und quantitativen Beurteilungen, und so sollte die Dezellularisierung immer an Übungsproben optimiert werden, bevor mit experimentellen Muskeln fortgefahren wird. Entfernen Sie vorsichtig das PBS, ersetzen Sie es durch ein gleiches Volumen von 3,7 % Formaldehyd oder 4 % Paraformaldehydlösung und legen Sie die Platte für 24 Stunden zurück in den Schaukelschüttler.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Formaldehydlösung den dezellularisierten Muskel vollständig bedeckt, da sonst die Färbung ungleichmäßig ist. 2. Visualisierung von IMAT mit ölrotem O Bereiten Sie eine Lösung von ORO vor.Lösen Sie 0,5 g ORO-Pulver (siehe Materialtabelle) in 100 ml Isopropanol auf, um eine Stammlösung zu erzeugen.HINWEIS: Fügen Sie der Lösung sanfte Hitze hinzu, um sie vollständig aufzulösen. Dieser Vorrat kann bei Raumtemperatur 1 Monat gelagert werden. Kombinieren Sie die ORO-Stammlösung mit deionisiertem Wasser in einem Verhältnis von 60:40, um die für alle Muskeln erforderliche Arbeitslösung mit einem Volumen von mindestens 0,1 ml/mg Muskelgewicht zu erhalten. Typische Volumina sind 6 ml, 3 ml und 1,5 ml für 6-, 12- bzw. 24-Well-Platten.HINWEIS: Untersuchen Sie die Stammlösung vor dem Mischen. Wenn die Stammlösung erhebliche Partikel enthält, stellen Sie frische Brühe her. Decken Sie die Arbeitslösung 10 Minuten lang ab, damit sich die Partikel absetzen können. Die Arbeitslösung wird durch ein 40-μm-Netz und anschließend durch einen 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter filtriert.HINWEIS: Der 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter verstopft schnell und muss ausgetauscht werden, wenn sich die Arbeitslösung nicht leicht durchdrücken lässt. Entfernen Sie die Formaldehyd- oder Paraformaldehydlösung und waschen Sie die dezellularisierten Muskeln mit drei Lösungswechseln eines gleichen PBS-Volumens. Ersetzen Sie das PBS durch ein gleiches Volumen von 60%iger Isopropanollösung und inkubieren Sie es 5 Minuten lang auf einem Schaukelschüttler. Ersetzen Sie die 60%ige Isopropanol-Lösung durch eine ORO-Arbeitslösung und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf dem Schaukelschüttler.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die ORO-Arbeitslösung den dezellularisierten Muskel vollständig bedeckt, da sonst die Färbung ungleichmäßig ist. Ersetzen Sie die ORO-Arbeitslösung durch ein gleiches Volumen von 1 % SDS. Überprüfen Sie die SDB-Lösung in regelmäßigen Abständen visuell. Wenn die Lösung merklich rosa wird, entfernen Sie die Lösung mit einer Pipette (achten Sie darauf, den Muskel nicht abzusaugen) und ersetzen Sie sie durch frisches 1% SDS. Wenn die Lösung 24 Stunden lang klar bleibt, ersetzen Sie das 1%ige SDS durch PBS und untersuchen Sie den gefärbten Muskel unter einem Präparier-/Stereomikroskop mit 4-facher Vergrößerung. Entferne alle offensichtlichen Ablagerungen oder Partikel, die an der Außenseite des Muskels haften. Ist diese großflächig, kann der dezellularisierte Muskel vorsichtig auf ein Reinigungstuch gerollt werden, um die Ablagerungen/Partikel abzuziehen. Wenn die Färbung zufriedenstellend ist (leuchtend rote Kugeln, die in einer transparenten Matrix schweben), nehmen Sie die gewünschten Bilder der Färbung mit einer am Stereomikroskop angebrachten Kamera auf (siehe Materialtabelle).HINWEIS: Wenn das Präpariermikroskop nicht über eine angeschlossene Kamera verfügt, kann eine Telefonkamera verwendet werden, um Bilder durch das Okular aufzunehmen. 3. Visualisierung von IMAT-Lipidtröpfchen mit BODIPY HINWEIS: Die konfokale Bildgebung ist am effektivsten bei dünnen Muskeln wie dem EDL oder dem Zwerchfell (~2 mm Dicke). Alternativ könnten auch vergleichbar dicke Muskelstreifen wie der TA verwendet werden. Bereiten Sie eine 1:200-Lösung des fluoreszierenden BODIPY 493/503 (siehe Materialtabelle) in PBS vor, um ein Arbeitslösungsvolumen von mindestens 0,1 ml/mg Muskelgewicht zu erhalten. Typische Volumina sind 6 ml, 3 ml und 1,5 ml für 6-, 12- bzw. 24-Well-Platten. Entfernen Sie das Formaldehyd, Paraformaldehyd oder 1% SDS und waschen Sie die dezellularisierten Muskeln mit drei Lösungswechseln eines gleichen Volumens PBS. Ersetzen Sie das PBS durch die BODIPY-Arbeitslösung und inkubieren Sie es 20 Minuten lang auf dem Schaukelschüttler. Waschen Sie die dezellularisierten Muskeln mit drei Lösungswechseln mit einem gleichen Volumen PBS. Platzieren Sie den Muskel in einem Gefäß mit klarem Boden, das mit einem verfügbaren konfokalen Mikroskop kompatibel ist. Im Idealfall hat die Schale einen vertieften Boden, um ein Deckglas über den Muskel zu legen, ohne ihn zu verformen (siehe Materialtabelle). Erfassen Sie Bildstapel mit einem konfokalen Standardmikroskop (siehe Materialtabelle) mit dem Laser 488. Typische Stapelgrößen für eine EDL sind 0,5-1 mm bei einer Schichtdicke von 10 μm, was 50-100 Bilder pro Stapel ergibt.HINWEIS: Um das Gesamtlipidvolumen, die Gesamtzahl der IMAT-Lipidtröpfchen und den Nächsten-Nachbar-Index der Clusterbildung zu quantifizieren, bilden Sie das gesamte Muskelvolumen ab, wobei darauf zu achten ist, dass einige Überlappungen für die Bildregistrierung übrig bleiben. Um das durchschnittliche Lipidtröpfchenvolumen zu quantifizieren, kann ein Stapel ausreichen. Falls gewünscht, färben Sie die Muskeln mit ORO, wie in Abschnitt 2 beschrieben, um ein komplementäres Gesamtmuskelbild der IMAT-Verteilung zu erhalten.HINWEIS: Da BODIPY fluoreszierend ist, ist es unter dem Lichtmikroskop nicht sichtbar, wenn Bilder von ORO aufgenommen werden. 4. Abschätzung des Gesamtlipidvolumens durch Lipidextraktion Übertragen Sie die Muskeln nach der Bildaufnahme in 200 μl Isopropanol in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte oder passen Sie die Vertiefung/das Volumen an, wenn der Muskel zu groß ist, um hinein zu passen. Rühren Sie die Lösung, indem Sie auf die Platte klopfen, die Lösung auf und ab pipettieren und/oder den Muskel mechanisch mit einer Pipettenspitze zerquetschen, bis unter dem Mikroskop keine roten/fluoreszierenden Kugeln mehr im dezellularisierten Muskel zu sehen sind.HINWEIS: Behandeln Sie alle Muskeln mit der gleichen Kombination aus Klopfen, Pipettieren und Zerkleinern, um die beste Zuverlässigkeit zu erzielen. Achten Sie auch darauf, die Zeit für das Klopfen, Pipettieren und Zerkleinern zu begrenzen, da das Isopropanol schnell verdunstet. Mischen Sie die Lösung in jeder Vertiefung, indem Sie sie auf und ab pipettieren, und geben Sie dann 75 μl in zwei saubere Vertiefungen der Platte. Decken Sie die Platte ab und lesen Sie die Absorption der doppelten 75-μl-Wells mit einem Spektralphotometer oder Plattenlesegerät ab. Wenn das Konstrukt mit ORO gefärbt wurde, lesen Sie die Lösung bei 500 nm ab. wenn es mit BODIPY 493/503 gefärbt wurde, lesen Sie die Platte bei 493 nm ab.HINWEIS: Wenn das Konstrukt sowohl mit BODIPY als auch mit ORO gefärbt wurde, wird empfohlen, die Platte bei 500 nm zu lesen, da 500 nm Lesevorgänge ähnliche Ergebnisse zwischen Konstrukten liefern, die nur mit ORO und ORO plus BODIBY gefärbt wurden. Dividieren Sie den Absorptionswert durch das aufgezeichnete Gewicht des Muskels, falls gewünscht, um Größenunterschiede zwischen den Proben zu korrigieren. 5. Quantifizierung von IMAT-Lipidtröpfchenmetriken aus konfokalen Bildern HINWEIS: Für diesen Abschnitt ist der Zugriff auf ImageJ Version 1.47 (siehe Materialtabelle) oder höher sowie grundlegende ImageJ-Kenntnisse40 erforderlich. Öffnen Sie konfokale Stapel in ImageJ.HINWEIS: Verschiedene konfokale Mikroskope können konfokale Bilder in unterschiedlichen Formaten speichern. ImageJ kann ein zusätzliches Plugin oder eine zusätzliche Variante, wie z. B. Fiji, benötigen, um die Stacks41 zu öffnen. Die verwendeten Algorithmen sind Teil des Softwarepakets ImageJ. Führen Sie einen Schwellenwertalgorithmus in ImageJ aus, um BODIPY-positive Pixel zu identifizieren. Dadurch wird das aktuelle Bild in ein binäres Bild konvertiert.Öffnen Sie die Benutzeroberfläche für den Schwellenwert, indem Sie Bild > > Schwellenwert anpassen auswählen. Wählen Sie in der Benutzeroberfläche Intermodes als Schwellenwerttyp aus, und stellen Sie sicher, dass Dunkler Hintergrund ausgewählt ist. Es müssen keine weiteren Optionen ausgewählt werden. Klicken Sie dann auf Übernehmen. Es wird ein Dialogfeld geöffnet, in dem Sie den Stapel in eine Binärdatei konvertieren können. Stellen Sie sicher, dass die folgenden Optionen ausgewählt sind: Methode: Intermodes; Hintergrund: Dunkel. Berechnen Sie den Schwellenwert für jedes Bild und den schwarzen Hintergrund (von binären Masken). Dadurch wird ein binärer Stapel generiert, wobei Weiß für positive BODIPY-Pixel und Schwarz für negative BODIPY-Pixel steht.HINWEIS: Der Intermodes-Schwellenwertalgorithmus ist möglicherweise nicht für alle Benutzer die beste Wahl. Die subjektive Überprüfung der integrierten Schwellwertoptionen von ImageJ hilft bei der Auswahl des optimalen Algorithmus für die Trennung von positiven und negativen BODIPY-Pixeln. Führen Sie den Watershed-Algorithmus in ImageJ aus, um sich berührende Lipidtröpfchen zu trennen. Wählen Sie > Binärdatei verarbeiten > Abflussgebiets aus. Es öffnet sich ein Dialogfenster, in dem Sie gefragt werden, ob alle Bilder im Stapel verarbeitet werden sollen. Wählen Sie Ja aus. Dadurch werden dünne schwarze Linien hinzugefügt, die größere Bereiche mit einfarbigem Weiß teilen. Identifizieren Sie ROIs mit dem Algorithmus “Partikel analysieren” in ImageJ.Wählen Sie ” Analysieren” > “Partikel analysieren” aus. Es öffnet sich ein Dialogfenster, in dem Sie die Auswahleinstellungen festlegen können.HINWEIS: Die Auswahl des Größenbereichs ist entscheidend, um die beste Schätzung der Lipidtröpfchen-ROIs zu erzielen. Die untere Grenze eliminiert Regionen, die wahrscheinlich zu klein sind, um IMAT-abgeleitete Lipidtröpfchen zu sein (Hintergrundartefakt), und die obere Grenze eliminiert Regionen, die wahrscheinlich zu groß sind, um einzelne IMAT-abgeleitete Lipidtröpfchen zu sein (die Lipidtröpfchen berühren, die nicht durch den Watershed-Algorithmus getrennt wurden). Um diese Werte festzulegen, öffnen Sie das Originalbild und umreißen Sie das kleinste und größte Lipidtröpfchen in der Ansicht mit dem ovalen Werkzeug. Fügen Sie diese Formen dann dem ROI-Manager hinzu, indem Sie “t” eingeben. Wählen Sie ” Analysieren” und dann “Messungen festlegen” aus. Es öffnet sich ein Dialogfenster zur Auswahl der Einstellungen.Aktivieren Sie nur Bereich und klicken Sie auf OK. Wählen Sie dann in der ROI-Krippe die Option Messen aus. Verwenden Sie die beiden Flächenkennzahlen aus diesem Ergebnisfenster als Größenbereich in Partikel analysieren. Stellen Sie sicher , dass Zum Manager hinzufügen aktiviert ist. Es werden keine weiteren Optionen benötigt. Überlagern Sie die ROIs mit dem konfokalen Stapel, indem Sie im ROI-Manager die Option Alle anzeigen aktivieren. Verwenden Sie den Schieberegler, um jedes Stapelsegment einzeln zu untersuchen und fehlende Bereiche von Hand mit dem Oval-Werkzeug (in der Symbolleiste ImageJ) hinzuzufügen. Geben Sie die ROI-Messungen aus. Wählen Sie ” Analysieren > Messungen festlegen ” und wählen Sie “Fläche”, ” Schwerpunkt”, “Ellipse anpassen ” und ” Stapelposition” aus. Klicken Sie auf OK. Wählen Sie dann in der ROI-Krippe die Option Messen aus. Die Daten in der Ergebnistabelle können ausgewählt und zur weiteren Analyse in Matlab oder Excel kopiert werden. Verfeinern Sie die ROIs in jedem Stack mit dem Refine.m Matlab-Code37 oder einem ähnlichen Algorithmus auf einen einzigen ROI.HINWEIS: Dieser Schritt ist erforderlich, da in den Schritten 5.2 bis 5.4 dasselbe Lipidtröpfchen in benachbarten Schichten als unterschiedliche ROIs identifiziert werden. Alternativ können ROIs jedoch auch nur von Hand identifiziert werden, oder doppelte ROIs können manuell in ImageJ eliminiert werden, um die Notwendigkeit von Matlab zu vermeiden. Rufen Sie die zusammenfassenden Statistiken im ROI mit Matlab oder Excel ab.Schätzen Sie die Gesamtzahl der Lipidtröpfchen als die Gesamtzahl der ROIs. Schätzen Sie das Lipidtröpfchenvolumen als das Volumen der Ellipse, die an jede 2D-ROI angepasst ist, und nehmen Sie an, dass die Tiefe der Form der Durchschnitt der Haupt- und Nebenachsen der Ellipse ist. Schätzen Sie das Gesamtlipidvolumen, das sich aus der Summe der einzelnen geschätzten Lipidtröpfchenvolumina ergibt.

Representative Results

Qualitative Visualisierung der Fettinfiltration der SkelettmuskulaturRichtig dezellularisierte Muskeln sind weiß und halbtransparent (Abschnitt 1; Abbildung 1). Wenn dezellularisierte Muskeln mit ORO gefärbt werden, um IMAT sichtbar zu machen (Abschnitt 2), sind IMAT-Lipidtröpfchen in den klaren Muskelstrukturen als rote Kugeln sichtbar (Abbildung 1). Gesunde Muskeln der Hintergliedmaßen von Mäusen weisen wenig natürliche IMAT auf, was sich in wenig bis gar keinem roten, ORO-positiven Lipid widerspiegelt (Abbildung 1A). Zum Vergleich: Mit Kardiotoxin injizierte Muskeln der Hintergliedmaßen (CTX; Abbildung 1B) oder Glycerin (GLY; Abbildung 1C) 14 Tage vor der Dezellularisierung eine erhöhte Akkumulation von IMAT aufweisen, mit einer größeren Konzentration von IMAT nach CTX im Vergleich zu GLY, wie bereits erwähnt37. Eine unvollständige Dezellularisierung kann unmittelbar nach der initialen SDS-Behandlung oder nach dem Auswaschen der ORO-Färbung als semi-opake, hellrosa Fasern identifiziert werden (Abbildung 2B im Vergleich zu Abbildung 2A). Eine unvollständige Clearance von ORO kann nach dem Auswaschen von ORO als rosa oder roter einheitlicher Hintergrund und nicht als ausgeprägte Faserlinien identifiziert werden (Abbildung 2C). Abbildung 2A,B enthält auch epimuskuläres Fett (Sternchen), einen Klumpen von Lipidtröpfchen außerhalb des dezellularisierten Muskels. Abbildung 2C zeigt auch die Muskelfaltung, die auftreten kann, wenn die Muskeln während der Dezellularisierung nicht gespreizt werden. Unvollständige Dezellularisierung, unvollständige ORO-Clearance und verbleibendes epimuskuläres Fettgewebe erhöhen alle künstlich die (OD) des extrahierten Lipids, behindern aber nicht unbedingt die qualitative Beurteilung der Fettinfiltration, wenn sie als Artefakt erkannt werden. Quantitative Bildgebung der Fettinfiltration der SkelettmuskulaturBODIPY-fluoreszenzmarkierte Lipidtröpfchen können mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet werden, um eine detailliertere Beurteilung der individuellen Lipidtröpfchenmetrik und -verteilung zu ermöglichen (Abbildung 3). Dieser Prozess ist, wie bereits beschrieben, halbautomatisch, einschließlich des Matlab-Codes37. Eine gute BODIPY-Färbung führt zu hellen elliptischen Formen, die sich von benachbarten Formen abgrenzen, wenn sie in der Ebene abgebildet werden (Abbildung 3A). Die Schwellenwert- und Formsegmentierung bietet einen guten ersten Durchlauf für die Generierung von ROIs für jedes Lipidtröpfchen (Abbildung 3B), aber zur Korrektur von Fehlern sind manuelle Bearbeitungen erforderlich. Der am weitesten verbreitete Fehler sind Lipidtröpfchen, die sich tief im Gewebe befinden und daher auf keinen Scheiben hell sind (Abbildung 3B; rosa Doppelpfeile). Dies kann behoben werden, indem ROIs manuell mit dem Oval-Werkzeug in ImageJ hinzugefügt werden (Abbildung 3C). Die zweite besteht darin, eine Gruppe von Lipidtröpfchen als einen einzigen ROI zu identifizieren (Abbildung 3B; rotes Sternchen). Dies kann korrigiert werden, indem der ursprüngliche ROI gelöscht und durch mehrere neue ROIs ersetzt wird (Abbildung 3D). Schließlich wird ein einzelnes Lipidtröpfchen als eindeutiger ROI in mehreren Schichten identifiziert, so dass die doppelten ROIs zu einem einzigen ROI konsolidiert werden müssen (Abbildung 3E; blauer Pfeil). Dies geht am einfachsten mit einem Datenverarbeitungstool wie Matlab, kann aber auch von Hand erfolgen, indem der größte ROI ermittelt und der Rest gelöscht wird. Durchschnittswerte für jede Metrik in der C57BL6/J- und 129Sv-Maus finden sich in Biltz et al.37. Abbildung 1: Beispiel für eine ölrote O (ORO)-Färbung dezellularisierter Muskeln. ORO-gefärbte Muskeln 14 Tage nach der Injektion mit Kochsalzlösung (SAL), Kardiotoxin (CTX) oder Glycerin (GLY). Die Musculus extensor digitorum longus (EDL) und Tibialis anterior (TA) der Maus haben bei der SAL-Behandlung (A) wenig IMAT (rote Kugeln), akkumulieren aber IMAT als Reaktion auf die Behandlung mit CTX (B) und GLY (C). Es kommt zu einer vollständigen Dezellularisierung und ORO-Auswaschung, die durch deutliche ORO-positive Lipidtröpfchen in einem transparenten weißen Muskelhintergrund belegt wird. Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Beispiele für schlechte ORO-Färbeergebnisse. Eine unvollständige Dezellularisierung oder unvollständige ORO-Clearance führt zu einem semi-opaken rosa/roten Hintergrund. Verglichen mit dem transparenten weißen Hintergrund des vollständig dezellularisierten Zwerchfellmuskels der Maus (A) ist die unvollständige Dezellularisierung durch hellrosa/rote Faserspuren (B) und die unvollständige ORO-Clearance durch einen diffusen rosa/roten Hintergrund (C) gekennzeichnet. Maßstabsleisten: obere Tafeln = 1 mm; untere Platten = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Beispiele für die Identifizierung einzelner Lipidtröpfchen mit fluoreszierender BODIPY-Färbung und konfokaler Mikroskopie Einzelne BODIPY-gefärbte Lipidtröpfchen können in dezellularisierten Muskeln mittels konfokaler Mikroskopie identifiziert und quantifiziert werden. Einzelne Schnitte durch einen konfokalen Stapel zeigen Lipidtröpfchen in der Ebene als hellgrüne Ellipsen und Lipidtröpfchen außerhalb der Ebene als schwächere Formen (A; blaue Pfeile). Schwellenwerte in Kombination mit der Segmentierung von Wassereinzugsgebieten und der ROI-Identifizierung können BODIPY-gefärbte ROIs abbilden (B). Bei der Schwellenbestimmung können einige schwächere Lipidtröpfchen übersehen werden (B; rosa Doppelpfeil), die von Hand identifiziert werden müssen (C). Bei der Segmentierung von Wassereinzugsgebieten können mehrere Lipidtröpfchen zusammengefasst werden (B; rotes Sternchen), was eine Löschung des ROI und eine erneute Schätzung von Hand erfordert (D). Derselbe Lipidtröpfchen wird in mehreren Schichten identifiziert, was eine Bildregistrierung (E) erfordert, um die doppelten ROIs zu löschen. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Dieses Manuskript beschreibt Methoden zur qualitativen Visualisierung und Quantifizierung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur in Kleintiermodellen, die zum weiteren Verständnis der Pathogenese der Entwicklung und pathologischen Ausdehnung von intramuskulärem Fettgewebe (IMAT) eingesetzt werden können. Die Verwendung der Dezellularisierung des gesamten Muskels und der lipidlöslichen Färbung ermöglicht eine kostengünstige, reproduzierbare und einfache Methodik, um das Vorhandensein von IMAT in ganzen Muskeln umfassend zu beurteilen.

Die Grundlage für dieses Protokoll ist, dass die Dezellularisierung des Muskels mit SDS die zellulären Bestandteile der Myofasern, einschließlich der kleinen Lipidtröpfchen von IMCL, entfernt, aber die großen Lipidtröpfchen in intramyozellulären Adipozyten verschont. SDS wurde in großem Umfang42 im Tissue Engineering zur Dezellularisierung von Matrizen eingesetzt. Gewebe wie Fett- und Skelettmuskulatur erfordern typischerweise eine zusätzliche mechanische Dissoziation und/oder Alkoholextraktion, um das verbleibende Adipozytenlipid zu entfernen42,43. Wir haben bereits gezeigt, dass dies darauf zurückzuführen ist, dass die Dezellularisierung mit SDS zwar IMCL eliminiert, aber das große Lipidtröpfchen in Adipozyten schont37. Die Bildgebung von Osmiumtetroxid-gefärbten intakten Muskeln vor und nach der Dezellularisierung mit μCT bestätigte, dass das räumliche Muster der IMAT durch die Dezellularisierung nicht gestört wurde. Darüber hinaus betrug die intramuskuläre Triglyceridquantifizierung in einem dezellularisierten Muskel mit vernachlässigbarem IMAT ~5% der intakten Muskelwerte, was die Entfernung von IMCL bestätigt. Daher behält diese Methode die IMAT-Lipidtröpfchen in ihrer ursprünglichen anatomischen Verteilung durch eine halbtransparente Muskelmatrix bei.

Die richtige Dezellularisierung ist der kritischste Schritt in diesem Protokoll. Wenn die Dezellularisierung unvollständig ist, sind IMAT-Lipidtröpfchen schwer sichtbar und verbleibende IMCL verursachen eine hohe Hintergrundfärbung entweder mit ORO oder BODIPY (Abbildung 2). Häufige Fehler bei unerfahrenen Anwendern sind eine unzureichende SDS-Abdeckung pro Muskel (innerhalb jeder Vertiefung), so dass jeder Muskel nicht vollständig mit SDS-Lösung bedeckt ist, die Verwendung einer Wippe zum Rühren der Lösung während der Dezellularisierung und die nicht häufig genug durchgeführte Lösungswechsel. In diesem Manuskript haben wir die Menge an SDS empfohlen, die pro Einheit Muskelmasse benötigt wird, aber der Benutzer muss immer noch sicherstellen, dass die Muskeln vollständig von Lösungen bedeckt sind, da jeder Muskel eine einzigartige Geometrie hat. Den Benutzern wird auch empfohlen, die Lösungen großzügig zu wechseln (bis zu zweimal pro Tag), um sicherzustellen, dass die Dezellularisierung abgeschlossen ist. Eine gute Qualität der Färbung von IMAT-Lipidtröpfchen wurde bereits nach 4 Tagen SDS-Behandlung erreicht. Für qualitativ hochwertige ORO-Färbeergebnisse sind auch eine angemessene Fixierung und Vorbereitung der ORO-Lösung wichtig. Ähnlich wie bei der oben beschriebenen SDS-Behandlung ist eine ausreichende Abdeckung von 3,7%iger Formaldehydlösung für jede Muskelprobe erforderlich. Wird der Muskel zu früh aus dem Fixiermittel entfernt, färben sich Lipidtröpfchen mit ORO nur schwach ab. Insgesamt sollte 1-2 h ausreichen, aber eine Fixierung über Nacht wird empfohlen, um sicherzustellen, dass das Fixiermittel in die Mitte des Muskels eindringt und alle Lipidtröpfchen vollständig fixiert. Eine zusätzliche Herausforderung bei der ORO-Färbung besteht darin, dass sich bei einer Reduzierung der Alkoholkonzentration auf 60 % ein Partikel bildet. Diese Partikel können sich an der Oberfläche absetzen und an der Muskelgrenze stecken bleiben. Der beste Weg, dies zu vermeiden, besteht darin, für jede Färbung eine neue Arbeitslösung herzustellen und sowohl 40 mesh μm als auch 0,22 μm Filter zu verwenden. Halten Sie dann die Bewegung mit der Wippe aufrecht und begrenzen Sie die Färbezeit auf 10 Minuten, um zu verhindern, dass sich Partikel absetzen, die sich bilden. Wenn das Problem weiterhin besteht, kann die Herstellung einer neuen ORO-Stammlösung helfen. Wenn ein Artefakt an der dezellularisierten Muskeloberfläche haften bleibt, können ein Stereomikroskop, eine Pinzette und eine chirurgische Schere verwendet werden, um dieses Artefakt zu entfernen. Wenn Artefakte nicht eliminiert werden, wirkt sich dies auf die Bildqualität der Muskeln aus und überschätzt den IMAT-Gehalt während der Lipidextraktion in Vorbereitung auf die OD-Messung.

Insgesamt ist diese Technik unkompliziert und bietet mehrere Vorteile gegenüber Goldstandard-Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur. Nicht-invasive Techniken wie CT, MRT und US, die in großem Umfang beim Menschen und manchmal auch in Tiermodellen eingesetzt werden, haben eine begrenzte räumliche Auflösung und sind nicht in der Lage, Lipidtröpfchen von Muskelfasern zu unterscheiden. So wird ein Pixel oder Voxel mit mittlerer Signalintensität als “Muskel” oder “Fett” bezeichnet, während es sich in Wirklichkeit wahrscheinlich um eine Mischung aus Myofasern und Adipozyten handelt. Häufiger wird die Fettinfiltration in tierischen Muskeln histologisch beurteilt, am häufigsten durch ORO in Muskelkryoschnitten. Dies wird jedoch in der Regel nur in einem einzigen repräsentativen Abschnitt durchgeführt und ist aufgrund der Lipidstreuung über den Abschnitt schwer zu quantifizieren. Im Gegensatz dazu bietet die ORO-Färbung eines ganzen dezellularisierten Muskels eine umfassende Beurteilung der IMAT mit ähnlichen Kosten und Aufwand wie die intakte Morphologie. Darüber hinaus ermöglicht die ORO-Färbung der Dezellularisierung nicht nur die Visualisierung, sondern auch die Quantifizierung der Fettinfiltration durch Lipidextraktion. Für einen tieferen Einblick in die Merkmale der Fettinfiltration kann eine Fluoreszenzfärbung, BODIPY, in Verbindung mit konfokaler Mikroskopie verwendet werden. Dies ermöglicht die Rekonstruktion einzelner IMAT-Lipidtröpfchen, um die 3D-Landschaft abzubilden, was mit der Histologie nicht möglich ist, es sei denn, es werden Schnitte über die Länge des Muskels analysiert. Ein konfokales Mikroskop gehört zwar nicht zur Standard-Laborausrüstung, ist aber in einer Universität oder Industrie eher zugänglich als die MRT oder CT von Kleintieren. Darüber hinaus kann ein Großteil dieses Prozesses automatisiert werden, wodurch der Zeitaufwand im Vergleich zur sequentiellen Histologie reduziert wird. Die Optimierung der Einstellungen am konfokalen Mikroskop ist eine zusätzliche Überlegung bei der BODIPY-Färbung. Diese sind für jedes Mikroskop einzigartig. Der kritische Wert ist die Laserintensität, die hoch genug sein muss, um die Lipidtröpfchen auf der entfernten Oberfläche des Muskels zu erkennen, ohne das Signal der Lipidtröpfchen auf der nahen Seite zu sättigen. Aus diesem Grund wird vorgeschlagen, dass die Verwendung der BODIPY-Färbung mit konfokaler Mikroskopie am besten für dünnere Muskeln, einschließlich EDL oder Zwerchfell, geeignet ist.

Mehrere Einschränkungen dieses Ansatzes bedürfen einer Diskussion. Erstens, während erwartet wird, dass diese Technik eine breite Anwendbarkeit über die hier vorgestellten Verletzungsmodelle (Kardiotoxin und Glycerin) hinaus hat, könnten neue Anwendungen (z. B. das MDX-Modell) eine Optimierung erfordern, da die Größe und Zusammensetzung des Muskels (z. B. Fibrose) die Dezellularisierung beeinflussen könnte, was eine erhöhte SDS-Konzentration oder Inkubationszeiten erfordert. Andere Krankheitsmodelle mit veränderter Muskelmasse würden ebenfalls eine Analyse sowohl absoluter als auch normalisierter (für die Muskelmasse) Metriken der Fettinfiltration erfordern, um die absolute Menge an Lipid oder den Prozentsatz der Lipide im Verhältnis zum Muskelvolumen zu bestimmen und ein aussagekräftigeres Ergebnismaß zu liefern. Darüber hinaus wird erwartet, dass diese Technik auf größere Tiermodelle und menschliche Biopsien anwendbar sein wird, was jedoch für jede neue Anwendung optimiert werden muss. Zweitens muss bei dieser Strategie der gesamte Muskel diesem Assay gewidmet sein und kann nicht zur Beurteilung eines anderen pathologischen Merkmals verwendet werden. Studien, die darauf abzielen, longitudinale Veränderungen der IMAT zu beurteilen, sind mit nicht-invasiven bildgebenden Verfahren besser bedient, und Studien, deren primäres Ziel den Muskel für andere Zwecke benötigt (Histologie, quantitative Polymerase-Kettenreaktion, Western Blotting), sind mit einer histologischen Beurteilung besser bedient, da der Rest des gefrorenen Muskels anderen Assays zugeordnet werden kann. Dieser Assay eignet sich jedoch gut für die Kombination mit In-vivo-Tests, wie z. B. dem Laufen auf dem Laufband oder dem kontraktilen Ex-vivo-Test, da diese Messungen vor der Dezellularisierung durchgeführt werden können44. Drittens, obwohl die Verwendung der BODIPY-Färbung mit konfokaler Mikroskopie eine hochauflösende Visualisierung und Quantifizierung von Lipidtröpfchen ermöglicht, kann sie Lipidtröpfchen nicht eindeutig als einzelne Adipozyten identifizieren, da die Zellmembran entfernt wird und endogene Adipozytenproteine verloren gehen. Multilokuläre Adipozyten, die unreife Adipozyten oder einen “braunen/beige”-Phänotyp repräsentieren, können als multiple Lipidtröpfchen identifiziert werden. Schließlich funktioniert das Protokoll nicht gut bei zuvor eingefrorenen Muskeln. Diese Einschränkungen sind wahrscheinlich am gravierendsten für menschliche Biopsien, da die gesamte Biopsie zwar dezellularisiert werden kann, die räumliche Verteilung von IMAT in der Biopsie jedoch wahrscheinlich nicht repräsentativer für den gesamten Muskel ist als ein histologischer Schnitt. Da diese Technik jedoch relativ unempfindlich gegenüber den Bedingungen der Handhabung von nicht gefrorenen Biopsien ist (z. B. Stunden auf Eis in PBS), könnte die Biopsie später für verschiedene Assays geteilt werden, einschließlich eines Teils für die Dezellularisierung, was eine bessere Auflösung einzelner Lipidtröpfchen ermöglichen würde.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine neuartige Methode zur qualitativen und quantitativen Analyse der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur entwickelt wurde, indem das zurückgehaltene Lipid dezellularisierter Konstrukte gefärbt und abgebildet wurde. Diese Methodik bietet Verbesserungen gegenüber Goldstandard-Ansätzen, da sie eine umfassende Bildgebung der dreidimensionalen Fettinfiltration im Muskel und eine schnelle, kostengünstige Quantifizierung mit ORO-Färbung ermöglicht. Für detailliertere Messungen bietet eine zweite lipidlösliche BODIPY-Färbung eine detailliertere Quantifizierung der Lipidtröpfchenanzahl, des Volumens und des Verteilungsmusters, wie durch konfokale Mikroskopie abgebildet. Zusammen bieten diese Maßnahmen den Forschern eine Möglichkeit, die Fettinfiltration der Skelettmuskulatur auf der Ebene der einzelnen Lipidtröpfchen präzise zu messen, ohne Proben zu nehmen oder teure nichtinvasive Bildgebung durchzuführen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von R01AR075773 to GAM unterstützt.

Materials

0.22 µm Syringe Filter Fisher Scientific SLGP033RS
1 mL LuerLock Syringes Fisher Scientific 14823434
12 mm Coverslips Fisher Scientific 12545F
12 well plates Fisher Scientific 08-772-29
24 well plates Fisher Scientific 08-772-1H
2-Propanol (Isopropanol) Sigma Aldrich I9516 0.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month.  Working solution must be made fresh.
37% Formaldehyde Solution Sigma Aldrich 8187081000
40 µm Mesh Filter Fisher Scientific 87711
6 well plates Fisher Scientific 08-772-1B
96 well plates Fisher Scientific 08-772-2C
BODIPY 493/503 Fisher Scientific D-3922
C57BL/6J Mice Jackson Laboratory 000664
Confocal Imaging Dish VWR 734-2905
Confocal Microscope Leica TCS SPEII
Dissecting/stereo Microscope Zeiss 4107009123001000
Dissection scissors Fine Science Tools 14060-09
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11254-20
Ethanol Fisher Scientific 033361.K2
ImageJ NIH
Matlab Mathworks
Oil Red O Powder Sigma Aldrich O0625
Plate reader Bio-tek Synergy II 
Rocker/Shaker Reliable Scientific 55D
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma Aldrich L3771 1% Solution can be stored at room temperature for 1 month
Transfer pipettes Fisher Scientific 137119D
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-00
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Parson, J. C., Biltz, N. K., Meyer, G. A. Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration. J. Vis. Exp. (196), e65461, doi:10.3791/65461 (2023).
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