כימות מבוסס דה-צלולריזציה של חדירת שומן בשרירי השלד

הטיפול וההקרבה של עכברים בוצעו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לשימוש וטיפול בחיות מעבדה. כל העבודה אושרה על ידי הוועדה ללימודי בעלי חיים באוניברסיטת וושינגטון בבית הספר לרפואה של סנט לואיס. עכברי C57BL/6J זכרים בגילאי 2-3 חודשים (ראה טבלת חומרים) שימשו ליצירת התמונות לדוגמה הכלולות בפרוטוקול זה. כל השלבים המתוארים להלן מבוצעים בטמפרטורת החדר. 1. דה-צלולריזציה של שרירים הכינו תמיסת סודיום דודציל סולפט 1% (SDS; ראו טבלת חומרים) במי מלח חוצצי פוספט (PBS). מערבבים את התמיסה עד לערבוב מלא.הערה: ניתן להכין SDS 1% בכמויות גדולות ולאחסן בטמפרטורת החדר למשך חודש אחד. לנתח את השרירים של עניין כפי שתואר קודם38,39.לחשוף את השרירים של עניין על ידי הרטבת השיער והעור עם תמיסת אתנול 70%, ולאחר מכן ביצוע חתך transcutaneous של כ 2 ס”מ ואחריו הסרת העור מכסה עם מלקחיים מספריים קפיץ.הערה: השרירים המעניינים כאן כוללים את הטיביאליס הקדמי (TA), extensor digitorum longus (EDL) וסרעפת. שרירים מסוימים עשויים להימצא עמוק בשרירים אחרים, מה שדורש דיסקציה של שרירים אחרים (למשל, ניתוח ה-EDL דורש הסרה של ה-TA). נתחו את השרירים המעניינים באמצעות מספריים או להבים חדים (ראו טבלת חומרים) כדי לוודא שכל היקף השריר מתקבל והקצוות חלקים.הערה: זה נעשה באופן אידיאלי תחת מיקרוסקופ מנתח כדי לשפר את ההדמיה. בדוק את השרירים כדי לוודא שאין שבבי עצם או קצוות משוננים, ולאחר מכן חתוך אותם עם מספריים חדים לפי הצורך. לשקול את השריר באמצעות איזון אנליטי ולרשום את המשקל. מקם את השריר מנותח לפחות 0.1 מ”ל של 1% SDS לכל מיליגרם של משקל; לוחות 6, 12 או 24 בארות עובדים היטב עבור שרירי העכבר בסרעפת, TA ו- EDL, בהתאמה. נפחים אופייניים הם 6 מ”ל, 3 מ”ל ו -1.5 מ”ל עבור לוחות 6, 12 ו -24 בארות, בהתאמה.הערה: תמיסת SDS לעיתים תגרום לעיוות השרירים, לכן יש לוודא שהשריר שטוח/מורחב בטבילה הראשונית. מניחים את צלחת הבאר (או כלים אחרים) על שייקר נדנדה להגדיר 50-80 הרץ. בדוק חזותית את פתרון SDS מעת לעת. כאשר התמיסה הופכת מעוננת, להסיר את התמיסה עם פיפטה (נזהר לא לשאוף את השריר) ולהחליף אותו עם נפח שווה של 1% SDS טרי. כאשר הפתרון נשאר ברור במשך 24 שעות, decellularization הושלם.הערה: התדירות הנדרשת לשינויי תמיסה משתנה בהתאם לגודל השריר ולנפח התמיסה הראשוני. שרירים גדולים יותר כמו TA זקוקים ל-SDS חדש תוך מספר שעות, ושרירים קטנים יותר כמו EDL יכולים לעבור בן לילה בפתרון המקורי. הסר את תמיסת SDS הסופית מהשרירים decellularized עם פיפטה (נזהר לא לשאוף את השריר) ולהחליף אותו עם נפח שווה של PBS. בדקו ויזואלית את השרירים הלא סלולריים תחת מיקרוסקופ מנתח והשתמשו במלקחיים ובמספריים כדי להסיר כל שערה או פסולת שנדבקה לשריר.הערה: כמו כן, שים לב לבהירות של שריר decellularized בשלב זה. אם השריר הדה-צלולרי אינו שקוף לחלוטין ותמיסת SDS אינה עולה בעכירות במשך 24 שעות, אזי הדה-צלולריזציה לא הייתה יעילה. זה יוצר חפץ בהערכות איכותיות וכמותיות, ולכן דה-צלולריזציה תמיד צריכה להיות אופטימלית על דגימות תרגול לפני שממשיכים עם שרירים ניסיוניים. הסר בזהירות את PBS, החלף אותו בנפח שווה של 3.7% פורמלדהיד או 4% תמיסת פרפורמלדהיד, והחזיר את הצלחת לשייקר הנדנדה למשך 24 שעות.הערה: ודא שתמיסת הפורמלדהיד מכסה במלואה את השריר נטול התא, אחרת הכתמים לא יהיו אחידים. 2. הדמיה של IMAT עם שמן אדום O הכינו פתרון של ORO.להמיס 0.5 גרם של אבקת ORO (ראה טבלה של חומרים) ב 100 מ”ל של isopropanol כדי ליצור פתרון מלאי.הערה: הוסף חום עדין לתמיסה כדי להמיס אותה במלואה. ניתן לאחסן מלאי זה בטמפרטורת החדר למשך חודש אחד. שלב את תמיסת המניות של ORO ומים נטולי יונים, ביחס של 60:40 כדי לקבל את פתרון העבודה הדרוש לכל השרירים באמצעות נפח של לפחות 0.1 מ”ל / מ”ג משקל שריר. נפחים אופייניים הם 6 מ”ל, 3 מ”ל ו -1.5 מ”ל עבור לוחות 6, 12 ו -24 בארות, בהתאמה.הערה: בדוק את תמיסת המלאי לפני הערבוב. אם תמיסת המלאי מכילה חלקיקים משמעותיים, הכינו מלאי טרי. כסו את פתרון העבודה למשך 10 דקות כדי לאפשר לחלקיקים לשקוע. סנן את פתרון העבודה דרך רשת של 40 מיקרומטר, ואחריה מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר.הערה: מסנן המזרק בגודל 0.22 מיקרומטר נסתם במהירות ויש להחליפו אם פתרון העבודה אינו עובר בקלות. הסר את תמיסת הפורמלדהיד או הפרפורמלדהיד ושטוף את השרירים הדה-צלולריים בשלושה שינויי תמיסה בנפח שווה של PBS. יש להחליף את PBS בתמיסת איזופרופנול בנפח שווה של 60% ולדגור על שייקר נדנדה למשך 5 דקות. החליפו את תמיסת האיזופרופנול 60% בתמיסת עבודה ORO ודגרו על שייקר הנדנדה למשך 10 דקות.הערה: ודא כי פתרון העבודה ORO מכסה באופן מלא את השריר decellularized, אחרת כתמים יהיה אחיד. החלף את פתרון העבודה ORO בנפח שווה של 1% SDS. בדוק חזותית את פתרון SDS מעת לעת. כאשר התמיסה הופכת ורודה באופן ניכר, להסיר את התמיסה עם פיפטה (נזהר לא לשאוף את השריר) ולהחליף אותו עם טרי 1% SDS. כאשר התמיסה נשארת ברורה למשך 24 שעות, החלף את SDS 1% ב- PBS ובדוק את השריר המוכתם תחת מיקרוסקופ ניתוח/סטריאו בהגדלה פי 4. הסר כל פסולת ברורה או חלקיקים דבוקים לחלק החיצוני של השריר. אם זה נרחב, ניתן לגלגל את השריר נטול התאים בעדינות על רקמת ניקוי כדי למשוך את הפסולת/חלקיקים. אם הצביעה משביעת רצון (כדורים אדומים בוהקים צפים במטריצה שקופה), רכשו תמונות של הצביעה כרצונכם באמצעות מצלמה המחוברת למיקרוסקופ הסטריאו (ראו טבלת חומרים).הערה: אם למיקרוסקופ המנתח אין מצלמה מחוברת, ניתן להשתמש במצלמת טלפון כדי לצלם תמונות דרך העינית. 3. הדמיה של טיפות שומנים IMAT עם BODIPY הערה: הדמיה קונפוקלית היא היעילה ביותר עם שרירים דקים כמו EDL או הסרעפת (~ 2 מ”מ עובי). לחלופין, ניתן להשתמש ברצועות בעובי דומה של שרירים כמו TA. הכן תמיסה 1:200 של BODIPY פלואורסצנטי 493/503 (ראה טבלת חומרים) ב- PBS כדי לקבל נפח פתרון עבודה של לפחות 0.1 מ”ל / מ”ג משקל שריר. נפחים אופייניים הם 6 מ”ל, 3 מ”ל ו -1.5 מ”ל עבור לוחות 6, 12 ו -24 בארות, בהתאמה. הסר את הפורמלדהיד, הפרפורמלדהיד או 1% SDS ושטוף את השרירים הדה-צלולריים בשלושה שינויי תמיסה בנפח שווה של PBS. החליפו את PBS בתמיסת העבודה BODIPY ודגרו על שייקר הנדנדה למשך 20 דקות. לשטוף את השרירים decellularized עם שלושה שינויים פתרון של נפח שווה של PBS. הניחו את השריר בכלי בעל תחתית שקופה התואם למיקרוסקופ קונפוקלי זמין. באופן אידיאלי, לצלחת תהיה תחתית שקועה כדי להניח כיסוי על השריר מבלי לעוות אותו (ראה טבלת חומרים). השג ערימות תמונות במיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי (ראה טבלת חומרים) באמצעות לייזר 488. גודלי ערימה אופייניים עבור EDL הם 0.5-1 מ”מ עם עובי פרוסה של 10 מיקרומטר, המפיקים 50-100 תמונות לערימה.הערה: כדי לכמת את נפח השומנים הכולל, את המספר הכולל של טיפות שומנים IMAT ואת אינדקס השכן הקרוב ביותר של אשכולות, תמונה דרך כל נפח השריר, תוך הקפדה להשאיר חפיפה מסוימת לרישום תמונה. כדי לכמת את נפח טיפת השומנים הממוצע, ערימה אחת עשויה להספיק. אם תרצה, הכתימו את השרירים ב- ORO, לפי סעיף 2, לקבלת תמונת שריר שלם משלימה של התפלגות IMAT.הערה: מכיוון ש- BODIPY הוא פלואורסצנטי, הוא לא ייראה תחת מיקרוסקופ האור כאשר תמונות של ORO נרכשות. 4. הערכת נפח השומנים הכולל על ידי מיצוי שומנים לאחר רכישת התמונה, העבירו את השרירים ל-200 מיקרוליטר איזופרופנול בבארות בודדות של צלחת בעלת 96 בארות, או התאימו את הבאר/נפח אם השריר גדול מכדי להתאים. הסעירו את התמיסה על ידי הקשה על הצלחת, פיטום התמיסה מעלה ומטה, ו / או ריסוק מכני של השריר עם קצה פיפטה עד שלא ניתן לראות כדורים אדומים/פלואורסצנטיים בשריר הלא סלולרי תחת מיקרוסקופ.הערה: טפל בכל השרירים באותו שילוב של הקשה, פיפטינג וריסוק לקבלת האמינות הטובה ביותר. כמו כן, דאגו להגביל את הזמן המושקע בהקשה, פיפטינג וריסוק, מכיוון שהאיזופרופנול יתאדה במהירות. מערבבים את התמיסה בכל באר על ידי pipetting למעלה ולמטה, ולאחר מכן להעביר 75 μL לשתי בארות נקיות של הצלחת. כסו את הצלחת וקראו את הספיגה של הבארות הכפולות של 75 μL באמצעות ספקטרופוטומטר או קורא לוחות. אם המבנה היה מוכתם עם ORO, לקרוא את הפתרון ב 500 ננומטר; אם הוא היה מוכתם עם BODIPY 493/503, לקרוא את הצלחת ב 493 ננומטר.הערה: אם המבנה היה מוכתם הן עם BODIPY והן עם ORO, מומלץ לקרוא את הלוח ב 500 ננומטר, כמו 500 ננומטר קריאות לתת תוצאות דומות בין מבנים מוכתמים ORO בלבד ו ORO בתוספת BODIPY. חלקו את קריאת הספיגה במשקל הרשום של השריר אם רוצים לתקן את הבדלי הגודל בין הדגימות. 5. כימות מדדי טיפות שומנים IMAT מתמונות קונפוקליות הערה: סעיף זה דורש גישה לגרסה 1.47 של ImageJ (ראה טבלת חומרים) ואילך ולמיומנויות בסיסיות של ImageJ40. פתח ערימות קונפוקליות ב- ImageJ.הערה: מיקרוסקופים קונפוקליים שונים עשויים לשמור תמונות קונפוקליות בפורמטים שונים. ImageJ עשוי לדרוש תוסף או גרסה נוספים, כגון פיג’י, כדי לפתוח את ערימות41. האלגוריתמים בהם נעשה שימוש הם חלק מחבילת התוכנה ImageJ. הפעל אלגוריתם סף ב- ImageJ כדי לזהות פיקסלים חיוביים של BODIPY. פעולה זו ממירה את התמונה הנוכחית לתמונה בינארית.פתח את ממשק המשתמש של הסף על-ידי בחירה באפשרות Image > Adjust > Threshold. בממשק המשתמש, בחר Intermodes כסוג הסף וודא שנבחר רקע כהה . אין צורך לבחור אפשרויות אחרות. לאחר מכן לחץ על החל. נפתחת תיבת דו-שיח להמרת האוסף לבינארי. ודא שנבחרו האפשרויות הבאות: שיטה: Intermodes; רקע: כהה. חשב את הסף לכל תמונה ורקע שחור (של מסיכות בינאריות). פעולה זו יוצרת ערימה בינארית, כאשר לבן מציין פיקסלים חיוביים של BODIPY ושחור מציין פיקסלים שליליים של BODIPY.הערה: ייתכן שאלגוריתם סף Intermodes אינו הבחירה הטובה ביותר עבור כל המשתמשים. בדיקה סובייקטיבית של אפשרויות הסף המובנות של ImageJ מסייעת לבחור את האלגוריתם האופטימלי להפרדת פיקסלים חיוביים ושליליים של BODIPY. הפעל את אלגוריתם פרשת המים ב- ImageJ כדי להפריד טיפות שומנים נוגעות. בחר תהליך > קו פרשת המים > בינארי. נפתחת תיבת דו-שיח השואלת אם יש לעבד את כל התמונות באוסף. בחר כן. פעולה זו מוסיפה קווים שחורים דקים המחלקים אזורים גדולים יותר של לבן מלא. זהה החזר השקעה באמצעות האלגוריתם Analyze Particles ב-ImageJ.בחר נתח > נתח חלקיקים. נפתחת תיבת דו-שיח לקביעת הגדרות הבחירה.הערה: בחירת טווח המידות היא קריטית להשגת האומדן הטוב ביותר של ROI טיפת שומנים. הגבול התחתון מבטל אזורים שסביר להניח שהם קטנים מכדי להיות טיפות שומנים שמקורן ב- IMAT (ממצא רקע), והחסם העליון מבטל אזורים שסביר להניח שהם גדולים מדי מכדי להיות טיפות שומנים בודדות שמקורן ב- IMAT (נגיעה בטיפות שומנים שלא הופרדו על ידי אלגוריתם פרשת המים). לקביעת ערכים אלה, פתחו את התמונה המקורית ושרטטו את טיפת השומנים הקטנה והגדולה ביותר המוצגת בעזרת הכלי אליפסה. לאחר מכן, הוסף צורות אלה למנהל החזר ההשקעה על-ידי הקלדת “t”. בחר נתח ולאחר מכן הגדר מדידות. נפתחת תיבת דו-שיח לבחירת ההגדרות.סמן את אזור בלבד ולחץ על אישור. לאחר מכן, בחר מדידה מאבוס החזר ההשקעה. השתמש בשני מדידות השטח מחלון תוצאות זה כטווח הגדלים בניתוח חלקיקים. ודא שהאפשרות הוסף למנהל מסומנת. אין צורך באפשרויות אחרות. שכב את החזר ההשקעה על הערימה הקונפוקלית על-ידי סימון הצג הכל במנהל החזר ההשקעה. השתמשו בפס המחוון כדי לבדוק כל פרוסת ערימה בנפרד ולהוסיף אזורים חסרים ידנית בעזרת הכלי אליפסה (הממוקם בסרגל הכלים ImageJ). הפק את מדידות החזר ההשקעה. בחרו ‘ נתח’ > ‘קבע מדידות ‘ ובחרו ‘אזור’, ‘ סנטרואיד’, ‘התאם אליפסה ‘ ו’מיקום מחסנית’. לחץ על אישור. לאחר מכן, בחר מדידה מאבוס החזר ההשקעה. ניתן לבחור את הנתונים בטבלת התוצאות ולהעתיק אותם ל- Matlab או Excel לצורך ניתוח נוסף. מקד את החזר ההשקעה בכל ערימה להחזר השקעה יחיד באמצעות קוד Refine.m Matlab37 או אלגוריתם דומה.הערה: שלב זה נדרש מכיוון ששלבים 5.2-5.4 מזהים את אותה טיפת שומנים בפרוסות סמוכות כהחזר השקעה נפרד. עם זאת, ניתן לחלופין לזהות ROI באופן ידני בלבד, או לבטל ROI כפול באופן ידני ב- ImageJ כדי למנוע את הצורך ב- Matlab. קבל את הנתונים הסטטיסטיים המסכמים בהחזר ההשקעה באמצעות Matlab או Excel.הערך את המספר הכולל של טיפות שומנים כמספר הכולל של החזר השקעה. הערך את נפח טיפת השומנים כנפח האליפסה המותאמת לכל החזר השקעה דו-ממדי, בהנחה שעומק הצורה הוא הממוצע של הצירים הראשיים והקטנים של האליפסה. הערך את נפח השומנים הכולל, שהוא סכום נפחי טיפות השומנים המשוערים הבודדים.