De huidige studie beschrijft op decellularisatie gebaseerde methodologieën voor het visualiseren en kwantificeren van intramusculair vetweefsel (IMAT) afzetting door middel van intact spiervolume, evenals het kwantificeren van statistieken van individuele adipocyten waaruit IMAT bestaat.
Vetinfiltratie is de ophoping van adipocyten tussen myovezels in skeletspieren en is een prominent kenmerk van veel myopathieën, stofwisselingsstoornissen en dystrofieën. Klinisch wordt in menselijke populaties vetinfiltratie beoordeeld met behulp van niet-invasieve methoden, waaronder computertomografie (CT), magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) en echografie (VS). Hoewel sommige onderzoeken CT of MRI hebben gebruikt om vetinfiltratie in muizenspieren te kwantificeren, blijven de kosten en onvoldoende ruimtelijke resolutie een uitdaging. Andere methoden voor kleine dieren maken gebruik van histologie om individuele adipocyten te visualiseren; Deze methodologie lijdt echter aan steekproefbias in heterogene pathologie. Dit protocol beschrijft de methodologie om vetinfiltratie kwalitatief te bekijken en kwantitatief te meten in de intacte muizenspier en op het niveau van individuele adipocyten met behulp van decellularisatie. Het protocol is niet beperkt tot specifieke spieren of specifieke soorten en kan worden uitgebreid tot menselijke biopsie. Bovendien kunnen grove kwalitatieve en kwantitatieve beoordelingen worden gemaakt met standaard laboratoriumapparatuur tegen lage kosten, waardoor deze procedure toegankelijker wordt voor alle onderzoekslaboratoria.
De ophoping van adipocyten tussen myovezels in de skeletspier is een prominent kenmerk van ongelijksoortige aandoeningen, van diabetes type 2 tot sarcopenie tot musculoskeletaal letsel 1,2,3,4,5,6,7. Een uitgebreide beoordeling van dit intramusculair vetweefsel (IMAT) is van cruciaal belang om de pathogenese van deze aandoeningen te begrijpen, aangezien IMAT-afzetting sterk gecorreleerd is met insulineresistentie 3,8,9,10 en een slechte skeletspierfunctie 11,12,13,14,15 . Hoewel deze associaties al tientallen jaren worden opgemerkt, blijven de mechanismen die verband houden met en de oorsprong van IMAT nog steeds een gebied van intensief onderzoek. Dit komt deels omdat de meeste onderzoeken naar de vetinfiltratie van skeletspieren zijn uitgevoerd bij mensen, waar mechanistisch onderzoek beperkt is16,17. Meer recentelijk zijn echter kleine diermodellen, waaronder muizen, gebruikt om de cellulaire regulatie van IMAT-ontwikkeling en -signalering vast te stellen18,19,20. Dit werk heeft tot doel een nieuw hulpmiddel te bieden voor gebruik met kleine diermodellen voor het kwalitatief visualiseren en kwantificeren van vetinfiltratie in skeletspieren.
Klinisch in menselijke populaties wordt vetinfiltratie beoordeeld met behulp van niet-invasieve methoden, waaronder computertomografie (CT)6,21, magnetische resonantiebeeldvorming (MRI)16,17,22,23 en echografie (VS)17,24. Deze beeldvormingstechnieken identificeren doorgaans een gedefinieerd interessegebied (ROI) in een spier en verkrijgen beeldsegmenten binnen dat gebied, hoewel er ook uitgebreide benaderingen zijn gebruikt25,26,27. Deze beeldsegmenten worden onderworpen aan kwalitatieve grading6 en gekwantificeerd via pixeldrempel28. Soortgelijke benaderingen zijn eerder gebruikt bij dieren29,30; Ze zijn echter kostbaar en vereisen toegang tot beeldvormingssystemen voor kleine dieren. Ruimtelijke resolutie via CT- en MRI-gebruik vormt ook een groot probleem, omdat ze IMAT-adipocyten niet kunnen afbakenen van skeletspiervezels in een voxel en in plaats daarvan vertrouwen op subjectieve scheiding van voornamelijk spierregio’s en voornamelijk IMAT-regio’s31,32. Als zodanig presenteert het onvermogen om vet- of spierweefsel nauwkeurig te identificeren ook een onnauwkeurige kwantificering van representatieve hoeveelheden van deze weefsels.
Vanwege deze beperkingen zijn de huidige technieken om vetinfiltratie van skeletspieren in kleine diermodellen te beoordelen meestal afhankelijk van histologie als een goedkoop en toegankelijk alternatief33,34. Standaard kleuringsprocedures, waaronder hematoxyline en eosine (H&E), olierode O (ORO) en immunokleuring voor adipocytmarkers zoals perilipine, maken eenvoudige detectie en visualisatie mogelijk van adipocyten die vetinfiltratie in de spier bevatten. Histologiebenaderingen zijn echter zelden alomvattend, en doorgaans is de kwalitatieve of kwantitatieve beoordeling van IMAT beperkt tot een enkele sectie34. Lipide-extractie is ook gebruikt om de totale spierlipiden te kwantificeren35; deze techniek maakt echter geen onderscheid tussen intramyocellulair lipide (IMCL) en intramusculair vetweefsel (IMAT)36. Samenvattend blijven de huidige methodologieën om vet in spieren te visualiseren en te kwantificeren beperkt door financiële kosten of de specifieke detectie van IMAT.
Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor het beoordelen van vetinfiltratie van skeletspieren, zowel door kwalitatieve visualisatie als kwantificering op meerdere schalen. Deze methodologie maakt gebruik van een eenvoudige decellularisatietechniek die myocellulaire structuren, waaronder IMCL, verwijdert, maar de grotere IMAT-adipocyt-afgeleide lipidedruppeltjes intact houdt. Validatie van de specificiteit van deze techniek is gepubliceerd37, waaronder het gebruik van lipide-extractie om de depletie van IMCL met decellularisatie aan te tonen, μCT om het behoud van IMAT-patronen met decellularisatie aan te tonen, en histologie om de vergelijkbare grootteverdeling van IMAT-lipidedruppeltjes aan te tonen in vergelijking met die geïdentificeerd met decellularisatie. Eenmaal gedecellulariseerd, kunnen spieren worden gekleurd met in vet oplosbare kleurstoffen voor kwalitatieve visualisatie van het patroon en de mate van vetinfiltratie en/of kwantitatieve beeldvorming van individuele IMAT-lipidedruppeltjes. Kleurstoffen kunnen vervolgens worden geëxtraheerd met isopropanol en de optische dichtheid (OD) van de resulterende oplossing kan worden gebruikt om het IMAT-lipidenvolume te schatten. De strenge validatie van deze techniek is elders gepubliceerd37. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor het gebruik van deze methodologie met muisspieren en geeft tips voor het oplossen van problemen ter ondersteuning van de toepassing van deze methode in andere toepassingen, zoals spieren van andere soorten of andere weefsels.
Dit manuscript beschrijft methoden om vetinfiltratie van skeletspieren in kleine diermodellen kwalitatief te visualiseren en te kwantificeren die kunnen worden toegepast om de pathogenese van de ontwikkeling en pathologische expansie van intramusculair vetweefsel (IMAT) beter te begrijpen. Het gebruik van decellularisatie van de hele spier en in vet oplosbare kleuring zorgt voor een kosteneffectieve, reproduceerbare en eenvoudige methodologie om de aanwezigheid van IMAT in hele spieren uitgebreid te beoordelen.
De basis voor dit protocol is dat decellularisatie van spieren met SDS de cellulaire componenten van myovezels verwijdert, inclusief de kleine lipidedruppeltjes van IMCL, maar de grote lipidedruppeltjes in intramyocellulaire adipocyten spaart. SDS is op grote schaal gebruikt42 in tissue engineering om matrices te decellulariseren. Weefsels zoals vet- en skeletspieren vereisen doorgaans extra mechanische dissociatie en/of alcoholextractie om het resterende adipocytlipide42,43 te verwijderen. We hebben eerder aangetoond dat dit komt omdat terwijl decellularisatie met SDS IMCL elimineert, het de grote lipidedruppel in adipocytenspaart37. Beeldvorming van osmiumtetroxide-gekleurde intacte spier pre- en post-decellularisatie met μCT bevestigde dat het ruimtelijke patroon van IMAT niet werd verstoord door decellularisatie. Verder was de kwantificering van intramusculaire triglyceriden in een gedecellulariseerde spier met verwaarloosbare IMAT ~5% van de intacte spierwaarden, waarmee de verwijdering van IMCL werd geverifieerd. Daarom behoudt deze methodologie IMAT-lipidedruppeltjes in hun oorspronkelijke anatomische verdeling via een semi-transparante spiermatrix.
Een goede decellularisatie is de meest kritische stap in dit protocol. Als de decellularisatie onvolledig is, zullen IMAT-lipidedruppeltjes moeilijk te visualiseren zijn en zal resterende IMCL een hoge achtergrondkleuring veroorzaken met ORO of BODIPY (Figuur 2). Veelvoorkomende fouten door onervaren gebruikers zijn onvoldoende SDS-dekking per spier (binnen elk putje), zodat elke spier niet volledig bedekt is met SDS-oplossing, het niet gebruiken van een tuimelschakelaar om de oplossing te roeren tijdens decellularisatie en het niet vaak genoeg uitvoeren van oplossingsveranderingen. In dit manuscript hebben we de hoeveelheid SDS aanbevolen die nodig is per eenheid spiermassa, maar de gebruiker zal er nog steeds voor moeten zorgen dat spieren volledig worden bedekt door oplossingen, aangezien elke spier een unieke geometrie heeft. Gebruikers wordt ook aangeraden om de oplossingen royaal te veranderen (tot twee keer per dag) om ervoor te zorgen dat de decellularisatie volledig is. Een goede kleuring van IMAT-lipidedruppeltjes is bereikt na maar liefst 4 dagen SDS-behandeling. Voor hoogwaardige ORO-kleuringsresultaten zijn ook voldoende fixatie en voorbereiding van de ORO-oplossing belangrijk. Net als bij de hierboven beschreven SDS-behandeling, is een adequate dekking van 3,7% formaldehyde-oplossing voor elk spiermonster nodig. Als de spier te vroeg uit het fixeermiddel wordt verwijderd, zullen lipidedruppeltjes slechts zwak kleuren met ORO. Een totaal van 1-2 uur zou voldoende moeten zijn, maar een nachtelijke fixatie wordt aanbevolen om ervoor te zorgen dat het fixeermiddel doordringt tot het midden van de spier en alle lipidedruppeltjes volledig fixeert. Een extra uitdaging bij ORO-kleuring is dat wanneer de alcoholconcentratie wordt verlaagd tot 60%, zich een deeltje begint te vormen. Dit deeltje kan zich op het oppervlak nestelen en vast komen te zitten op de rand van spieren. De beste manier om dit te voorkomen, is door voor elke kleuring een nieuwe werkoplossing te maken en zowel filters van 40 mesh μm als 0.22 μm te gebruiken. Door vervolgens de tuimelaar in beweging te houden en de kleuringstijd te beperken tot 10 minuten, wordt voorkomen dat eventuele deeltjes die zich vormen bezinken. Als het probleem aanhoudt, kan het helpen om een nieuwe ORO-voorraadoplossing te maken. Als een artefact aan het gedecellulariseerde spieroppervlak blijft kleven, kunnen een stereomicroscoop, een pincet en een chirurgische schaar worden gebruikt om dit artefact te verwijderen. Het niet elimineren van artefacten heeft invloed op de beeldkwaliteit van spieren en overschat het IMAT-gehalte tijdens het lipide-extractiegedeelte ter voorbereiding op OD-meting.
Over het algemeen is deze techniek eenvoudig en biedt ze verschillende voordelen ten opzichte van gouden standaardmethoden voor het visualiseren en kwantificeren van vetinfiltratie in skeletspieren. Niet-invasieve technieken, zoals CT, MRI en US, die op grote schaal worden gebruikt bij mensen en soms in diermodellen, hebben een beperkte ruimtelijke resolutie en zijn niet in staat om lipidedruppeltjes te onderscheiden van spiervezels. Zo wordt een pixel of voxel met een gemiddelde signaalintensiteit toegewezen als “spier” of “vet”, terwijl het in werkelijkheid waarschijnlijk een mix is van myovezels en adipocyten. Vaker wordt vetinfiltratie in dierlijke spieren beoordeeld door histologie, meestal door ORO in spiercryosecties. Dit wordt echter meestal alleen uitgevoerd in een enkele representatieve sectie en is moeilijk te kwantificeren vanwege de lipidenverstrooiing over de sectie. ORO-kleuring van een volledige gedecellulariseerde spier biedt daarentegen een uitgebreide beoordeling van IMAT met vergelijkbare kosten en inspanningen als intacte morfologie. Bovendien maakt ORO-kleuring van decellularisatie, naast het verbeteren van de visualisatie, de kwantificering van vetinfiltratie door lipide-extractie mogelijk. Voor een diepere duik in de kenmerken van vetinfiltratie kan een fluorescerende kleurstof, BODIPY, worden gebruikt in combinatie met confocale microscopie. Dit maakt de reconstructie van individuele IMAT-lipidedruppeltjes mogelijk om het 3D-landschap in kaart te brengen, wat niet mogelijk is met histologie, tenzij secties over de lengte van de spier worden geanalyseerd. Hoewel een confocale microscoop geen standaard laboratoriumapparatuur is, is de kans groter dat deze toegankelijk is in een universitaire of industriële omgeving dan MRI of CT van kleine dieren. Bovendien kan een groot deel van dit proces worden geautomatiseerd, waardoor de tijdskosten worden verlaagd in vergelijking met sequentiële histologie. Het optimaliseren van de instellingen op de confocale microscoop is een extra overweging voor BODIPY-kleuring. Deze zijn uniek voor elke microscoop. De kritische waarde is de laserintensiteit, die hoog genoeg moet zijn om de lipidedruppeltjes op het verre oppervlak van de spier te detecteren en tegelijkertijd het signaal van de lipidedruppeltjes aan de nabije kant niet te verzadigen. Daarom wordt gesuggereerd dat het gebruik van BODIPY-kleuring met confocale microscopie het meest geschikt is voor dunnere spieren, waaronder de EDL of het middenrif.
Verschillende beperkingen van deze benadering verdienen discussie. Ten eerste, hoewel wordt verwacht dat deze techniek breed toepasbaar is buiten letselmodellen (cardiotoxine en glycerol) bij muizen die hier worden gepresenteerd, kunnen nieuwe toepassingen (bijv. het mdx-model) optimalisatie vereisen, omdat de grootte en samenstelling van de spier (bijv. fibrose) de decellularisatie kunnen beïnvloeden, waardoor een verhoogde SDS-concentratie of incubatietijd nodig is. Andere ziektemodellen met veranderde spiermassa zouden ook analyse vereisen van zowel absolute als genormaliseerde (naar spiermassa) metriek van vetinfiltratie om de absolute hoeveelheid lipide of percentage lipide ten opzichte van het spiervolume te bepalen om een zinvollere uitkomstmaat te bieden. Bovendien wordt verwacht dat deze techniek breed toepasbaar zal zijn op grotere diermodellen en menselijke biopten, maar dit kan voor elke nieuwe toepassing optimalisatie vereisen. Ten tweede moet in deze strategie de hele spier aan deze test worden gewijd en kan deze niet worden gebruikt om een ander pathologisch kenmerk te beoordelen. Studies die gericht zijn op het beoordelen van longitudinale veranderingen in IMAT zijn beter gediend met niet-invasieve beeldvormingstechnieken en studies waarvan het primaire doel de spier voor andere doeleinden vereist (histologie, kwantitatieve polymerasekettingreactie, western blotting) zijn beter gediend met histologische beoordeling, aangezien de rest van de bevroren spier kan worden toegewezen aan andere tests. Deze test is echter zeer geschikt om te combineren met in vivo testen, zoals hardlopen op een loopband, of ex vivo contractiele testen, aangezien deze maatregelen kunnen worden genomen vóór decellularisatie44. Ten derde, hoewel het gebruik van BODIPY-kleuring met confocale microscopie visualisatie en kwantificering van lipidedruppeltjes met hoge resolutie biedt, kan het lipidedruppeltjes niet definitief identificeren als individuele adipocyten, omdat het celmembraan wordt verwijderd en endogene adipocyteiwitten verloren gaan. Multiloculaire adipocyten, die onrijpe adipocyten of een “bruin/beige” fenotype vertegenwoordigen, kunnen worden geïdentificeerd als meerdere lipidedruppeltjes. Ten slotte werkt het protocol niet goed op eerder ingevroren spieren. Deze beperkingen zijn waarschijnlijk het meest ingrijpend voor menselijke biopsieën, want hoewel de hele biopsie kan worden gedecellulariseerd, is de ruimtelijke verdeling van IMAT in de biopsie waarschijnlijk niet representatiever voor de hele spier dan een histologische plak. Aangezien deze techniek echter relatief ongevoelig is voor niet-bevroren biopsiebehandelingsomstandigheden (bijv. uren op ijs in PBS), zou de biopsie later kunnen worden verdeeld voor verschillende tests, waaronder een deel voor decellularisatie, wat een betere resolutie van individuele lipidedruppeltjes zou opleveren.
Concluderend is een nieuwe methode ontwikkeld voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de infiltratie van skeletspiervet door het vastgehouden lipide van gedecellulariseerde constructen te kleuren en in beeld te brengen. Deze methodologie biedt verbeteringen ten opzichte van gouden standaardbenaderingen, in die zin dat het uitgebreide beeldvorming van driedimensionale vetinfiltratie in spieren en snelle, goedkope kwantificering met ORO-kleuring mogelijk maakt. Voor meer gedetailleerde metingen biedt een tweede in lipiden oplosbare BODIPY-kleuring een meer gedetailleerde kwantificering van het aantal, het volume en het distributiepatroon van lipidedruppels, zoals afgebeeld door confocale microscopie. Samen bieden deze maatregelen onderzoekers een manier om de vetinfiltratie van skeletspieren nauwkeurig te meten op het niveau van de individuele lipidedruppeltjes zonder bemonstering of dure niet-invasieve beeldvorming.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door R01AR075773 aan GAM.
0.22 µm Syringe Filter | Fisher Scientific | SLGP033RS | |
1 mL LuerLock Syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
12 mm Coverslips | Fisher Scientific | 12545F | |
12 well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
24 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
2-Propanol (Isopropanol) | Sigma Aldrich | I9516 | 0.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month. Working solution must be made fresh. |
37% Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 8187081000 | |
40 µm Mesh Filter | Fisher Scientific | 87711 | |
6 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
96 well plates | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
BODIPY 493/503 | Fisher Scientific | D-3922 | |
C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
Confocal Imaging Dish | VWR | 734-2905 | |
Confocal Microscope | Leica | TCS SPEII | |
Dissecting/stereo Microscope | Zeiss | 4107009123001000 | |
Dissection scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 033361.K2 | |
ImageJ | NIH | ||
Matlab | Mathworks | ||
Oil Red O Powder | Sigma Aldrich | O0625 | |
Plate reader | Bio-tek | Synergy II | |
Rocker/Shaker | Reliable Scientific | 55D | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | 1% Solution can be stored at room temperature for 1 month |
Transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119D | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 |