Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması
Summary
Bu protokol, tomurcuklanan maya, Saccharomyces cerevisiae’den doğal kromatin bağlamında ilgilenilen tek kopyalı bir gen lokusunu saflaştırmak için bölgeye özgü rekombinasyona dayalı lokusa özgü bir kromatin izolasyon yöntemi sunar.
Abstract
Ökaryotik kromatinin temel organizasyon birimi, bir histon oktamerinin etrafına ~1.7 kez sarılmış DNA’yı içeren nükleozom çekirdek parçacığıdır (NCP). Kromatin, NCP’lerin ve transkripsiyon faktörleri, kromatin yeniden şekillenmesi ve modifiye edici enzimler dahil olmak üzere çok sayıda başka protein kompleksinin varlığı olarak tanımlanır. Bu protein-DNA etkileşimlerinin, hücre döngüsünün farklı aşamalarında spesifik genomik lokuslar düzeyinde nasıl düzenlendiği hala belirsizdir. Bunun başlıca nedeni, bu tür dinamik etkileşimlerin hassas ölçümlerini elde etmeyi zorlaştıran mevcut teknik sınırlamalardır. Burada, doğal kromatin durumunda ilgilenilen tek kopyalı bir gen lokusunu izole etmek için bölgeye özgü rekombinasyonu verimli bir tek adımlı afinite saflaştırma protokolü ile birleştiren geliştirilmiş bir yöntemi açıklıyoruz. Yöntem, hedef lokusun genomik kromatin üzerinde sağlam bir şekilde zenginleştirilmesine izin vererek, bu tekniği protein etkileşimlerini tarafsız ve sistematik bir şekilde, örneğin kütle spektrometrisi ile tanımlamak ve ölçmek için etkili bir strateji haline getirir. Bu tür bileşimsel analizlere ek olarak, bu yöntemle saflaştırılan doğal kromatin, muhtemelen nükleozom konumlandırma ve histon modifikasyonları ile ilgili in vivo durumu yansıtır ve bu nedenle, mayadaki hemen hemen her genomik lokustan türetilen kromatinin daha ileri yapısal ve biyokimyasal analizlerine uygundur.
Introduction
Ökaryotik genomların kromatine dinamik organizasyonu, DNA’yı çekirdeğin sınırlarına sığacak şekilde sıkıştırırken, gen ekspresyonu için yeterli dinamikleri ve düzenleyici faktörler için erişilebilirliği sağlar. Kısmen, bu çok yönlülüğe, histon oktamer1’in etrafına ~1.7 kez sarılmış 147 bp DNA’ya sahip bir çekirdek parçacığı içeren kromatinin temel birimi olan nükleozom aracılık eder. Nükleozom, N ve C terminal histon kuyruklarında çok sayıda histon varyantı ve posttranslasyonel modifikasyon (PTM’ler) ile bileşimine göre oldukça dinamik bir yapıdır. Ayrıca, ökaryotik kromatin, transkripsiyon faktörleri, DNA ve RNA işleme makineleri, mimari proteinler, kromatinin yeniden şekillenmesi ve modifikasyonunda yer alan enzimler ve kromatin ile ilişkili RNA molekülleri gibi çok sayıda başka temel bileşenle etkileşime girer. Transkripsiyon, replikasyon ve onarımda yer alan bu önemli makinelerin tümü, bu işlemler için doğal substrat görevi gören kromatine erişim gerektirir. Sonuç olarak, bu DNA işlemlerinin altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılması, bu makinelerin birleştiği ve biyolojik reaksiyonları kolaylaştırdığı spesifik genomik bölgelerdeki kromatin yapısındaki kolektif değişikliklerin kesin bir tanımını gerektirir.
Genetik ve protein-protein etkileşimi çalışmaları yoluyla çok sayıda kromatin faktörünün tanımlanmasına rağmen, belirli genomik bölgelerde kromatin etkileşimlerinin doğrudan, tarafsız ve kapsamlı analizlerinin yapılması önemli bir engel olarak kalmıştır 2,3. Başlangıçta, genomun yalnızca yüksek oranda bol bölgeleri (yani, tekrarlayan lokuslar) veya çok kopyalı plazmitler, ilişkili proteinlerinkütle spektrometrik tanımlaması için yeterli miktarda ve saflıkta izole edilebilirdi 4,5,6,7. Yakalama problarının kromatinize DNA’ya doğrudan hibridizasyonuna, CRISPR-dCas9 sistemi kullanılarak yakınlık biyotinilasyonuna veya diziye özgü adaptör proteinlerinin ilgilenilen lokusa bağlanmasına dayanan bir dizi yeni yaklaşım, maya ve memeli genomlarından tek kopya lokusların proteomunu çözmeye başlamıştır 8,9,10. Bununla birlikte, tüm bu yöntemler, protein-DNA etkileşimlerini stabilize etmek için formaldehit çapraz bağlama ve sonraki saflaştırma için kromatini çözündürmek için sonikasyon gerektirir. Birlikte, her iki manipülasyon da saflaştırılmış kromatinin müteakip yapısal ve fonksiyonel çalışmaları olasılığını dışlar.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, daha önce maya 11,12’den hedeflenen kromozomal alanları çıkarmak için bölgeye özgü rekombinasyon kullanan bir metodoloji tasarladık. Özünde, ilgilenilen genomik bölge, Zygosaccharomyces rouxi’den bölgeye özgü R-rekombinaz için tanıma bölgeleri (RS) ile çevrilidir ve aynı zamanda aynı bölgedeki prokaryotik transkripsiyonel baskılayıcı LexA proteini (LexA) için üç DNA bağlanma bölgesinden oluşan bir grup içerir. Maya hücreleri, R-rekombinazın eşzamanlı ekspresyonu için bir ekspresyon kaseti ve bir tandem afinite saflaştırma (TAP) etiketine kaynaşmış bir LexA proteini içerir. R-rekombinazın indüksiyonundan sonra, enzim hedeflenen bölgeyi kromozomdan dairesel bir kromatin alanı şeklinde verimli bir şekilde çıkarır. Bu alan, LexA DNA bağlanma bölgelerine ve ayrıca bir afinite desteğine bağlanan LexA-TAP adaptör proteini aracılığıyla saflaştırılabilir. Bu yöntem son zamanlarda maya kromozomu III13’ün seçilmiş replikasyon kökenlerini içeren farklı kromatin alanlarını izole etmek için kullanılmıştır.
Bu ex vivo yaklaşımın en büyük avantajlarından biri, izole edilmiş malzemenin fonksiyonel analizlerine izin vermesidir. Örneğin, bu yöntemle saflaştırılan replikasyon orijin alanları, doğal in vivo montajlı kromatin şablonlarından bir test tüpünde orijin ateşlemesinin verimliliğini değerlendirmek için in vitro replikasyon testlerine tabi tutulabilir. Sonuç olarak, izole edilmiş materyalin biyokimyasal ve fonksiyonel karakterizasyonu, doğal kromatin şablonu ile birlikte saflaştırılmış proteinler kullanılarak nükleer işlemlerin yeniden oluşturulmasına izin verebilir. Özetle, bu metodoloji, belirli bir kromozomal işlem geçiren belirli bir genomik bölgenin kolektif bileşimsel ve yapısal kromatin değişikliklerini takip etmek mümkün olacağından, kromatin araştırmalarında heyecan verici bir yol açar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belirli bir hedef genomik bölgenin faktörlerinin ve kromatin manzarasının tanımlanması, kromatin araştırmalarında büyük bir zorluk oluşturmaya devam etmektedir18. Bu protokol, maya kromozomlarından farklı kromatin alanlarını spesifik olarak çıkarmak ve saflaştırmak için etkili bir sistemi tanımlar. Bildiğimiz kadarıyla, bu tek aşamalı saflaştırmanın saflığı ve verimi, lokusa özgü kromatin saflaştırma yöntemlerinin birçok sınırlamasının üstesinden gelir, b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.H. laboratuvarındaki çalışmalar, SFB1064 (proje kimliği 213249687), Avrupa Araştırma Konseyi (ERC Başlangıç Hibesi 852798 Çatışma Çözümü) ve Helmholtz Gesellschaft aracılığıyla DFG tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Yeast strains | |||
| Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, see references 13 and 14 | ||
| Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, see reference 13 and 14 | ||
| Plasmid | |||
| K238 plasmid | Section 1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C |
||
| K071 Spike-in plasmid DNA | Section 7.1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C |
||
| Reagents | |||
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium acetate (NH4Ac) | Sigma Aldrich | A7262 | Section 6 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium solution (NH4OH) 25% | Merck Millipore | 533003 | Section 6 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium sulfate | Santa Cruz | Sc-29085 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Bacto agar | BD (VWR) | 90000-760 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Bacto peptone | BD (VWR) | 211820 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 07604 | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Chemiluminescent substrate kit | ThermoFisher | 34580 | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate | Merck | 1.06579.1000 | Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher | 15508013 | Section 4 Storage: Store at 4 °C |
| Ethanol | Merck | 100983 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Galactose (20% (w/v) stock) | Sigma Aldrich | G0625-1KG / 5KG | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Gel loading dye (6x) | BioLabs | B7024A | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Glusose | Sigma-Aldrich | G8270 | Section Storage: Store at room temperature |
| Glycine | Carl Roth | .0079.4 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Glycogen (5 mg/mL) | Invitrogen | AM9510 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Hydrochloric acid (HCl) | PanReac AppliChem | 182109.1211 | Section 2, 4 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Magnesium Acetate (MgAc) | Bernd Kraft | 15274.2600/C035 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M8266 | Section 6 Storage: Store at room temperature |
| Nu PAGE LDS sample buffer (4x) | Invitrogen | 2399549 | Section 7.2 Storage: Store at room temperature |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) | Invitrogen | 15593-031 | Section 7.1 Storage: Store at 4 °C |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) | Hartmann Analytic | SRP-203 | Section 7.1 Storage: Store at 4 °C |
| RadPrime labeling system | ThermoFisher | 18428-011 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Raffinose (20% (w/v) stock) | SERVA | 34140.03 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | K53710504142 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | Sigma-Aldrich | 71402 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) | Alfa Aesar | A11183 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium azide | Santa Cruz Biotechnology | sc-208393 | Section 2 Storage: Store at -20 °C |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90340 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Tris base | Chem Cruz | SC-3715B | Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature |
| Tween-20 | Bernd Kraft | 18014332 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Yeast extract | BD (VWR) | 212720 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock ) | Biomol | Y2016.5 | Section 3 Storage: Store at -20 °C |
| Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE | Sigma Aldrich | Y1376 | Section 1, see reference 14 |
| Enzymes | |||
| HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) | NEB | R0105S | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | ThermoFisher Scientific | 78446 | Section 4 Storage: Store at4 °C |
| Proteinase K (10 mg/mL) | SERVA | 33756 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| RNase A (10 mg/mL) | ThermoFisher | EN0531 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| TEV protease (10000 U/µL) | NEB | P8112S | Section 5 Storage: Store at -20 °C |
| Materials | |||
| BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads | Bioclone Inc. | FC-102 | Section 2 Storage: Store at 4 °C |
| Dry ice | Section 4 | ||
| Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Section 4 |
| Microspin G-25 Columns | Cytiva | 27-5325-01 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Parafilm | Merck | P7793 | Section 4 |
| Positive nylon membrane | Biozol | 11MEMP0001 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| PVDF transfer membrane | Immobilon-Merck Millipore | IPVH00010 | Section 7.2 Storage: Store at room temperature |
| SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) | Invitrogen | NP0336BOX | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Syringe (25 mL) with luer fitting | Henke Sass Wolf | 4200-000V0 | Section 3 |
| Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) | Cytiva | 3030-917 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Antibodies | |||
| Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody | Merck Millipore | 06-719 | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate | Invitrogen | G21234 | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins | Sigma Aldrich | P1291-500UL | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Rabbit IgG antibodies | Sigma | I5006-100MG | Section 2 Storage: Store at 4 °C |
| Primers (10 µM) | |||
| ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT | Section 7.1 | ||
| K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT | Section 7.1 | ||
| PCR fragment from yeast genomic DNA as a template for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT | Section 7.1 | ||
| PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT | Section 7.1 | ||
| Equipment | |||
| Coffee grinder | Gastroback | 42601 | Section 4 |
| Dewar flask | NAL GENE | 4150-2000 | Section 3 |
| DynaMag TM-2 magnetic rack | Invitrogen | 12321D | Section 4, 5 and 6 |
| Hybridization oven | Hybaid Mini10 | Ri418 | Section 2 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | Section 4 and 7.1 |
| UV-crosslinker | Analytikjena | 95-0174-02 | Section 7.1 |
References
- Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
- Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
- Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542 (2018).
- Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674 (2015).
- Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430 (2010).
- Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
- Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
- Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111 (2017).
- Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
- Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2 (2014).
- Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045 (2023).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023)
- Vermeulen, M., Déjardin, J. Locus-specific chromatin isolation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).
