Summary

Single-Copy Gene Locus Chromatine Zuivering in Saccharomyces cerevisiae

Published: November 17, 2023
doi:

Summary

Dit protocol presenteert een locus-specifieke chromatine-isolatiemethode op basis van plaatsspecifieke recombinatie om een single-copy genlocus van belang in zijn natuurlijke chromatinecontext te zuiveren van ontluikende gist, Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

De basisorganisatorische eenheid van eukaryotisch chromatine is het nucleosoomkerndeeltje (NCP), dat bestaat uit DNA dat ~1,7 keer rond een histon-octameer is gewikkeld. Chromatine wordt gedefinieerd als de entiteit van NCP’s en tal van andere eiwitcomplexen, waaronder transcriptiefactoren, chromatine-remodellering en modificerende enzymen. Het is nog onduidelijk hoe deze eiwit-DNA-interacties worden georkestreerd op het niveau van specifieke genomische loci tijdens verschillende stadia van de celcyclus. Dit is voornamelijk te wijten aan de huidige technische beperkingen, die het moeilijk maken om nauwkeurige metingen van dergelijke dynamische interacties te verkrijgen. Hier beschrijven we een verbeterde methode die plaatsspecifieke recombinatie combineert met een efficiënt single-step affiniteitszuiveringsprotocol om een single-copy genlocus van belang te isoleren in zijn oorspronkelijke chromatinetoestand. De methode maakt de robuuste verrijking van de doellocus ten opzichte van genoomchromatine mogelijk, waardoor deze techniek een effectieve strategie is voor het identificeren en kwantificeren van eiwitinteracties op een onbevooroordeelde en systematische manier, bijvoorbeeld door massaspectrometrie. Afgezien van dergelijke samenstellingsanalyses weerspiegelt het met deze methode gezuiverde natieve chromatine waarschijnlijk de in vivo situatie met betrekking tot nucleosoompositionering en histonmodificaties en is het daarom vatbaar voor verdere structurele en biochemische analyses van chromatine dat is afgeleid van vrijwel elke genomische locus in gist.

Introduction

De dynamische organisatie van eukaryote genomen in chromatine comprimeert het DNA om binnen de grenzen van de kern te passen, terwijl het zorgt voor voldoende dynamiek voor genexpressie en toegankelijkheid voor regulerende factoren. Voor een deel wordt deze veelzijdigheid gemedieerd door het nucleosoom, de basiseenheid van chromatine, die bestaat uit een kerndeeltje met 147 bp DNA dat ~1,7 keer rond het histonoctameer1 is gewikkeld. Het nucleosoom is een zeer dynamische structuur met betrekking tot zijn samenstelling, met talrijke histonvarianten en posttranslationele modificaties (PTM’s) op de N- en C-terminale histonstaarten. Bovendien interageert eukaryotisch chromatine met een groot aantal andere essentiële componenten, zoals transcriptiefactoren, DNA- en RNA-verwerkingsmachines, architecturale eiwitten, enzymen die betrokken zijn bij de remodellering en modificatie van chromatine, en RNA-moleculen die verband houden met chromatine. Deze cruciale machines die betrokken zijn bij transcriptie, replicatie en reparatie vereisen allemaal toegang tot chromatine, dat dient als het natuurlijke substraat voor deze processen. Bijgevolg vereist het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze DNA-transacties een nauwkeurige definitie van de collectieve veranderingen in de chromatinestructuur in de specifieke genomische regio’s waar deze machines samenkomen en biologische reacties vergemakkelijken.

Ondanks de identificatie van talrijke chromatinefactoren door middel van genetica en eiwit-eiwitinteractiestudies, is het uitvoeren van directe, onbevooroordeelde en uitgebreide analyses van chromatine-interacties op bepaalde genomische locaties een belangrijk obstakel gebleven 2,3. Aanvankelijk konden alleen zeer overvloedige regio’s van het genoom (d.w.z. repetitieve loci) of plasmiden met meerdere kopieën in voldoende hoeveelheden en zuiverheid worden geïsoleerd voor massaspectrometrische identificatie van de geassocieerde eiwitten 4,5,6,7. Een reeks nieuwe benaderingen op basis van de directe hybridisatie van capture-sondes tot gechromatineerd DNA, nabijheidsbiotinylering met behulp van het CRISPR-dCas9-systeem of de binding van sequentiespecifieke adaptereiwitten aan de locus van belang zijn begonnen met het ontrafelen van het proteoom van single-copy loci uit het genoom van gist en zoogdieren 8,9,10. Al deze methoden vereisen echter formaldehyde-verknoping om de eiwit-DNA-interacties te stabiliseren en sonicatie om het chromatine op te lossen voor latere zuivering. Samen sluiten beide manipulaties de mogelijkheid uit van latere structurele en functionele studies van het gezuiverde chromatine.

Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we eerder een methodologie bedacht die plaatsspecifieke recombinatie gebruikt om gerichte chromosomale domeinen uit gist11,12 te extraheren. In wezen is het genomische gebied van belang omgeven door herkenningsplaatsen (RS) voor de plaatsspecifieke R-recombinase van Zygosaccharomyces rouxi, terwijl tegelijkertijd een groep van drie DNA-bindingsplaatsen voor het prokaryote transcriptionele repressor-LexA-eiwit (LexA) in dezelfde regio wordt opgenomen. De gistcellen bevatten een expressiecassette voor de gelijktijdige expressie van R-recombinase en een LexA-eiwit dat is gefuseerd met een tandem affiniteitszuivering (TAP)-tag. Na de inductie van R-recombinase snijdt het enzym het beoogde gebied efficiënt uit het chromosoom in de vorm van een cirkelvormig chromatinedomein. Dit domein kan worden gezuiverd via het LexA-TAP-adaptereiwit, dat zich bindt aan de LexA-DNA-bindingsplaatsen, evenals aan een affiniteitsondersteuning. Deze methode is onlangs gebruikt om verschillende chromatinedomeinen te isoleren die geselecteerde replicatie-oorsprong van gistchromosoom III13 bevatten.

Een groot voordeel van deze ex vivo benadering is dat het functionele analyses van het geïsoleerde materiaal mogelijk maakt. Replicatieoorsprongsdomeinen die met deze methode zijn gezuiverd, kunnen bijvoorbeeld worden onderworpen aan in-vitroreplicatietests om de efficiëntie van het afvuren van de oorsprong in een reageerbuis te beoordelen op basis van native in vivo geassembleerde chromatinesjablonen. Uiteindelijk kan de biochemische en functionele karakterisering van het geïsoleerde materiaal de reconstitutie van nucleaire processen mogelijk maken met behulp van gezuiverde eiwitten samen met het native chromatine-sjabloon. Samenvattend opent deze methodologie een opwindende weg in chromatine-onderzoek, omdat het mogelijk zal zijn om de collectieve samenstellings- en structurele chromatineveranderingen van een specifiek genoomgebied dat een bepaalde chromosomale transactie ondergaat, te volgen.

Protocol

Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt. Zie tabel 1 voor een lijst van de gebruikte oplossingen, buffers en media. 1. Recombinante giststamconstructie Om een recombinatiecompetente giststam te construeren, transformeert u SbfI-verteerd plasmide K238 in een giststam met geïntegreerde LexA-bindingsplaatsen en RS-recombinatieplaatsen op de plaats van bel…

Representative Results

De zuivering van het ~1,4 kb ARS316 chromatinedomein werd gemedieerd door het constitutief tot expressie gebrachte LexA-TAP-adaptereiwit. Om als negatieve controle te dienen, voerden we zuiveringen uit met behulp van een isogene stam die LexA-TAP tot expressie brengt, maar geen geïntegreerde RS- en LexA-bindingsplaatsen bevat. Figuur 3 illustreert het resultaat van de DNA-analyse van een standaard zuiveringsexperiment dat is uitgevoerd op zowel de controlegroep als een recombinatiecompetent…

Discussion

De identificatie van de factoren en het chromatinelandschap van een specifieke genomische doelregio blijft een grote uitdaging vormen in het chromatineonderzoek18. Dit protocol beschrijft een efficiënt systeem om specifiek verschillende chromatinedomeinen uit gistchromosomen te snijden en te zuiveren. Voor zover wij weten, overwinnen de zuiverheid en opbrengst van deze eenstapszuivering veel van de beperkingen van locusspecifieke chromatinezuiveringsmethoden, waardoor een zeer hoge verrijking van…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Het werk in het S.H.-laboratorium werd ondersteund door de DFG via SFB1064 (project-ID 213249687), de European Research Council (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) en de Helmholtz Gesellschaft.

Materials

Yeast strains
Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see references 13 and 14
Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see reference 13 and 14
Plasmid
K238 plasmid Section 1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
K071 Spike-in plasmid DNA Section 7.1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
Reagents
Acetone Carl Roth 5025.1 Section 2
Storage: Store at room temperature
Ammonium acetate (NH4Ac) Sigma Aldrich A7262 Section 6 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Ammonium solution (NH4OH) 25% Merck Millipore 533003 Section 6
Storage: Store at room temperature
Ammonium sulfate Santa Cruz Sc-29085 Section 2
Storage: Store at room temperature
Bacto agar BD (VWR) 90000-760 Section 3
Storage: Store at room temperature
Bacto peptone BD (VWR) 211820 Section 3
Storage: Store at room temperature
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 07604 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Chemiluminescent substrate kit ThermoFisher 34580 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate Merck 1.06579.1000 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher 15508013 Section 4
Storage: Store at 4 °C
Ethanol Merck 100983 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Galactose (20% (w/v) stock) Sigma Aldrich G0625-1KG  /  5KG Section 3
Storage: Store at room temperature
Gel loading dye (6x) BioLabs B7024A Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Glusose Sigma-Aldrich G8270 Section
Storage: Store at room temperature
Glycine Carl Roth .0079.4 Section 2
Storage: Store at room temperature
Glycogen (5 mg/mL) Invitrogen AM9510 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl) PanReac AppliChem 182109.1211 Section 2, 4 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Magnesium Acetate (MgAc) Bernd Kraft 15274.2600/C035 Section 4
Storage: Store at room temperature
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma Aldrich M8266 Section 6
Storage: Store at room temperature
Nu PAGE LDS sample buffer (4x) Invitrogen 2399549 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) Invitrogen 15593-031 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
Potassium chloride (KCl) Sigma P9541 Section 4
Storage: Store at room temperature
Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) Hartmann Analytic SRP-203 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
RadPrime labeling system ThermoFisher 18428-011 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Raffinose (20% (w/v) stock) SERVA 34140.03 Section 3
Storage: Store at room temperature
Sodium chloride (NaCl) Merck K53710504142 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium citrate (Na3C6H5O7) Sigma-Aldrich 71402 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) Alfa Aesar A11183 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 71496 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium azide Santa Cruz Biotechnology sc-208393 Section 2
Storage: Store at -20 °C
 Triethylamine Sigma Aldrich 90340 Section 2
Storage: Store at room temperature
Tris base Chem Cruz SC-3715B Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Tween-20 Bernd Kraft 18014332 Section 4
Storage: Store at room temperature
Yeast extract BD (VWR) 212720 Section 3
Storage: Store at room temperature
Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock )  Biomol Y2016.5 Section 3
Storage: Store at -20 °C
Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE Sigma Aldrich Y1376 Section 1, see reference 14
Enzymes
HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) NEB R0105S Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) ThermoFisher Scientific 78446 Section 4
Storage: Store at4 °C
Proteinase K (10 mg/mL) SERVA 33756 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
RNase A (10 mg/mL)  ThermoFisher EN0531 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
TEV protease (10000 U/µL) NEB P8112S Section 5
Storage: Store at -20 °C
Materials
BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads Bioclone Inc. FC-102 Section 2
Storage: Store at 4 °C
Dry ice Section 4
Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL Eppendorf 22431102 Section 4
Microspin G-25 Columns Cytiva 27-5325-01 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Parafilm Merck P7793 Section 4
Positive nylon membrane Biozol 11MEMP0001 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
PVDF transfer membrane Immobilon-Merck Millipore IPVH00010 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) Invitrogen  NP0336BOX Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Syringe (25 mL) with luer fitting Henke Sass Wolf 4200-000V0 Section 3
Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) Cytiva 3030-917 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Antibodies
Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody Merck Millipore 06-719 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate Invitrogen G21234 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins Sigma Aldrich P1291-500UL Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Rabbit IgG antibodies Sigma I5006-100MG Section 2
Storage: Store at 4 °C
Primers (10 µM)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT Section 7.1
K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT Section 7.1
PCR fragment from yeast genomic DNA as a template  for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                  rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT Section 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT Section 7.1
Equipment
Coffee grinder Gastroback 42601 Section 4
Dewar flask NAL GENE 4150-2000 Section 3
DynaMag TM-2 magnetic rack Invitrogen 12321D Section 4, 5 and 6
Hybridization oven Hybaid Mini10 Ri418 Section 2
Microcentrifuge Eppendorf 5424R Section 4 and 7.1
UV-crosslinker Analytikjena 95-0174-02 Section 7.1

References

  1. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
  2. Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
  3. Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542 (2018).
  4. Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
  5. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
  6. Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674 (2015).
  7. Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430 (2010).
  8. Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
  9. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
  10. Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111 (2017).
  11. Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
  12. Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2 (2014).
  13. Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045 (2023).
  14. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  16. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  17. Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023)
  18. Vermeulen, M., Déjardin, J. Locus-specific chromatin isolation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).

Play Video

Cite This Article
Sajid, A., Hamperl, S. Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (201), e65460, doi:10.3791/65460 (2023).

View Video