Summary

نسخة واحدة من تنقية الكروماتين لموضع الجين في Saccharomyces cerevisiae

Published: November 17, 2023
doi:

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة عزل الكروماتين الخاصة بالموقع بناء على إعادة التركيب الخاصة بالموقع لتنقية موضع جين أحادي النسخة مهم في سياق الكروماتين الأصلي من الخميرة الناشئة ، Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

الوحدة التنظيمية الأساسية للكروماتين حقيقي النواة هي جسيم النواة الأساسي (NCP) ، والذي يشتمل على الحمض النووي ملفوف ~ 1.7 مرة حول أوكتامير هستون. يعرف الكروماتين بأنه كيان NCPs والعديد من مجمعات البروتين الأخرى ، بما في ذلك عوامل النسخ وإعادة تشكيل الكروماتين وتعديل الإنزيمات. لا يزال من غير الواضح كيف يتم تنظيم تفاعلات البروتين والحمض النووي هذه على مستوى مواقع جينومية محددة خلال مراحل مختلفة من دورة الخلية. ويرجع ذلك أساسا إلى القيود التقنية الحالية ، والتي تجعل من الصعب الحصول على قياسات دقيقة لمثل هذه التفاعلات الديناميكية. هنا ، نصف طريقة محسنة تجمع بين إعادة التركيب الخاصة بالموقع وبروتوكول تنقية تقارب فعال أحادي الخطوة لعزل موضع جين أحادي النسخة مهم في حالة الكروماتين الأصلية. تسمح هذه الطريقة بالتخصيب القوي للموضع المستهدف على الكروماتين الجينومي ، مما يجعل هذه التقنية استراتيجية فعالة لتحديد وقياس تفاعلات البروتين بطريقة غير متحيزة ومنهجية ، على سبيل المثال عن طريق قياس الطيف الكتلي. بالإضافة إلى هذه التحليلات التركيبية ، من المحتمل أن يعكس الكروماتين الأصلي المنقى بهذه الطريقة الوضع في الجسم الحي فيما يتعلق بتحديد موضع النيوكليوسوم وتعديلات الهستون ، وبالتالي فهو قابل لمزيد من التحليلات الهيكلية والكيميائية الحيوية للكروماتين المشتق من أي موضع جينومي تقريبا في الخميرة.

Introduction

إن التنظيم الديناميكي للجينومات حقيقية النواة في الكروماتين يضغط الحمض النووي ليتناسب مع حدود النواة مع ضمان ديناميكيات كافية للتعبير الجيني وإمكانية الوصول إلى العوامل التنظيمية. جزئيا ، يتم التوسط في هذا التنوع بواسطة النيوكليوسوم ، الوحدة الأساسية للكروماتين ، والتي تضم جسيما أساسيا يحتوي على 147 نقطة أساس من الحمض النووي ملفوفة ~ 1.7 مرة حول أوكتامير هيستون1. النيوكليوسوم هو هيكل ديناميكي للغاية فيما يتعلق بتكوينه ، مع العديد من متغيرات الهستون وتعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) على ذيول هيستون N- و C-terminal. علاوة على ذلك ، يتفاعل الكروماتين حقيقي النواة مع العديد من المكونات الأساسية الأخرى ، مثل عوامل النسخ ، وآلات معالجة الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، والبروتينات المعمارية ، والإنزيمات المشاركة في إعادة تشكيل الكروماتين وتعديله ، وجزيئات الحمض النووي الريبي المرتبطة بالكروماتين. تتطلب جميع هذه الأجهزة الحاسمة المشاركة في النسخ والتكرار والإصلاح الوصول إلى الكروماتين ، والذي يعمل كركيزة طبيعية لهذه العمليات. وبالتالي ، فإن فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء معاملات الحمض النووي هذه يتطلب تعريفا دقيقا للتغيرات الجماعية في بنية الكروماتين في المناطق الجينومية المحددة حيث تتلاقى هذه الأجهزة وتسهل التفاعلات البيولوجية.

على الرغم من تحديد العديد من عوامل الكروماتين من خلال دراسات الوراثة والتفاعل بين البروتين والبروتين ، فإن إجراء تحليلات مباشرة وغير متحيزة وشاملة لتفاعلات الكروماتين في مواقع جينومية معينة ظل يمثل عقبة كبيرة 2,3. في البداية ، يمكن فقط عزل المناطق الوفيرة للغاية من الجينوم (أي المواقع المتكررة) أو البلازميدات متعددة النسخ بكميات كافية ونقاء لتحديد مطياف الكتلة للبروتينات المرتبطة4،5،6،7. بدأت سلسلة من الأساليب الجديدة القائمة على التهجين المباشر لمجسات الالتقاط إلى الحمض النووي المصبوغ بالكروماتين ، أو البيوتينيل القريب باستخدام نظام CRISPR-dCas9 ، أو ربط بروتينات المحولات الخاصة بالتسلسل بموضع الاهتمام في كشف بروتين المواقع أحادية النسخة من جينومات الخميرة والثدييات8،9،10. ومع ذلك ، تتطلب كل هذه الطرق تشابك الفورمالديهايد لتحقيق الاستقرار في تفاعلات البروتين والحمض النووي وصوتنة لإذابة الكروماتين للتنقية اللاحقة. معا ، يستبعد كلا التلاعب إمكانية إجراء دراسات هيكلية ووظيفية لاحقة للكروماتين المنقى.

للتغلب على هذه القيود ، ابتكرنا سابقا منهجية تستخدم إعادة التركيب الخاصة بالموقع لاستخراج المجالات الكروموسومية المستهدفة من الخميرة11,12. في جوهرها ، فإن المنطقة الجينومية ذات الأهمية محاطة بمواقع التعرف (RS) ل R-recombinase الخاص بالموقع من Zygosaccharomyces rouxi مع دمج مجموعة من ثلاثة مواقع ربط الحمض النووي في نفس الوقت لبروتين LexA الخامع للنسخ بدائي النواة (LexA) داخل نفس المنطقة. تحتوي خلايا الخميرة على شريط تعبير للتعبير المتزامن ل R-recombinase وبروتين LexA مدمج في علامة تنقية التقارب الترادفي (TAP). بعد تحريض R-recombinase ، يقوم الإنزيم بكفاءة باستئصال المنطقة المستهدفة من الكروموسوم في شكل مجال كروماتين دائري. يمكن تنقية هذا المجال عبر بروتين محول LexA-TAP ، الذي يرتبط بمواقع ربط الحمض النووي LexA ، بالإضافة إلى دعم التقارب. تم استخدام هذه الطريقة مؤخرا لعزل مجالات الكروماتين المتميزة التي تحتوي على أصول تكرار مختارة لكروموسوم الخميرة III13.

تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذا النهج خارج الجسم الحي في أنه يسمح بإجراء تحليلات وظيفية للمادة المعزولة. على سبيل المثال ، يمكن إخضاع مجالات أصل النسخ المتماثل المنقاة بهذه الطريقة لمقايسات النسخ المتماثل في المختبر لتقييم كفاءة إطلاق الأصل في أنبوب اختبار من قوالب الكروماتين المجمعة الأصلية في الجسم الحي . في نهاية المطاف ، قد يسمح التوصيف الكيميائي الحيوي والوظيفي للمادة المعزولة بإعادة تكوين العمليات النووية باستخدام البروتينات النقية جنبا إلى جنب مع قالب الكروماتين الأصلي. باختصار ، تفتح هذه المنهجية طريقا مثيرا في أبحاث الكروماتين ، حيث سيكون من الممكن متابعة التغيرات التركيبية والهيكلية الجماعية للكروماتين لمنطقة جينومية معينة تخضع لمعاملة كروموسومية معينة.

Protocol

انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول. انظر الجدول 1 للحصول على قائمة بالحلول والمخازن المؤقتة والوسائط المستخدمة. 1. بناء سلالة الخميرة المؤتلفة لبناء سلالة خميرة مختصة بإعادة الت?…

Representative Results

تم تنقية مجال الكروماتين ARS316 ~ 1.4 كيلو بايت بواسطة بروتين محول LexA-TAP المعبر عنه بشكل أساسي. لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي ، أجرينا عمليات تنقية باستخدام سلالة متساوية المنشأ تعبر عن LexA-TAP ولكنها لا تحتوي على مواقع ربط RS و LexA مدمجة. يوضح الشكل 3 نتائج تحليل الحمض النووي من تجربة ت?…

Discussion

لا يزال تحديد العوامل ومشهد الكروماتين لمنطقة جينومية مستهدفة محددة يشكل تحديا كبيرا في أبحاث الكروماتين18. يصف هذا البروتوكول نظاما فعالا لاستئصال وتنقية مجالات الكروماتين المميزة على وجه التحديد من كروموسومات الخميرة. على حد علمنا ، فإن نقاء وإنتاجية هذا التنقية أحادية ال…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم العمل في مختبر S.H. من قبل DFG من خلال SFB1064 (معرف المشروع 213249687) ، ومجلس البحوث الأوروبي (ERC Start Grant 852798 ConflictResolution) ، و Helmholtz Gesellschaft.

Materials

Yeast strains
Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see references 13 and 14
Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see reference 13 and 14
Plasmid
K238 plasmid Section 1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
K071 Spike-in plasmid DNA Section 7.1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
Reagents
Acetone Carl Roth 5025.1 Section 2
Storage: Store at room temperature
Ammonium acetate (NH4Ac) Sigma Aldrich A7262 Section 6 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Ammonium solution (NH4OH) 25% Merck Millipore 533003 Section 6
Storage: Store at room temperature
Ammonium sulfate Santa Cruz Sc-29085 Section 2
Storage: Store at room temperature
Bacto agar BD (VWR) 90000-760 Section 3
Storage: Store at room temperature
Bacto peptone BD (VWR) 211820 Section 3
Storage: Store at room temperature
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 07604 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Chemiluminescent substrate kit ThermoFisher 34580 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate Merck 1.06579.1000 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher 15508013 Section 4
Storage: Store at 4 °C
Ethanol Merck 100983 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Galactose (20% (w/v) stock) Sigma Aldrich G0625-1KG  /  5KG Section 3
Storage: Store at room temperature
Gel loading dye (6x) BioLabs B7024A Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Glusose Sigma-Aldrich G8270 Section
Storage: Store at room temperature
Glycine Carl Roth .0079.4 Section 2
Storage: Store at room temperature
Glycogen (5 mg/mL) Invitrogen AM9510 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl) PanReac AppliChem 182109.1211 Section 2, 4 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Magnesium Acetate (MgAc) Bernd Kraft 15274.2600/C035 Section 4
Storage: Store at room temperature
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma Aldrich M8266 Section 6
Storage: Store at room temperature
Nu PAGE LDS sample buffer (4x) Invitrogen 2399549 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) Invitrogen 15593-031 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
Potassium chloride (KCl) Sigma P9541 Section 4
Storage: Store at room temperature
Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) Hartmann Analytic SRP-203 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
RadPrime labeling system ThermoFisher 18428-011 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Raffinose (20% (w/v) stock) SERVA 34140.03 Section 3
Storage: Store at room temperature
Sodium chloride (NaCl) Merck K53710504142 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium citrate (Na3C6H5O7) Sigma-Aldrich 71402 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) Alfa Aesar A11183 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 71496 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium azide Santa Cruz Biotechnology sc-208393 Section 2
Storage: Store at -20 °C
 Triethylamine Sigma Aldrich 90340 Section 2
Storage: Store at room temperature
Tris base Chem Cruz SC-3715B Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Tween-20 Bernd Kraft 18014332 Section 4
Storage: Store at room temperature
Yeast extract BD (VWR) 212720 Section 3
Storage: Store at room temperature
Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock )  Biomol Y2016.5 Section 3
Storage: Store at -20 °C
Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE Sigma Aldrich Y1376 Section 1, see reference 14
Enzymes
HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) NEB R0105S Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) ThermoFisher Scientific 78446 Section 4
Storage: Store at4 °C
Proteinase K (10 mg/mL) SERVA 33756 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
RNase A (10 mg/mL)  ThermoFisher EN0531 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
TEV protease (10000 U/µL) NEB P8112S Section 5
Storage: Store at -20 °C
Materials
BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads Bioclone Inc. FC-102 Section 2
Storage: Store at 4 °C
Dry ice Section 4
Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL Eppendorf 22431102 Section 4
Microspin G-25 Columns Cytiva 27-5325-01 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Parafilm Merck P7793 Section 4
Positive nylon membrane Biozol 11MEMP0001 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
PVDF transfer membrane Immobilon-Merck Millipore IPVH00010 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) Invitrogen  NP0336BOX Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Syringe (25 mL) with luer fitting Henke Sass Wolf 4200-000V0 Section 3
Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) Cytiva 3030-917 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Antibodies
Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody Merck Millipore 06-719 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate Invitrogen G21234 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins Sigma Aldrich P1291-500UL Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Rabbit IgG antibodies Sigma I5006-100MG Section 2
Storage: Store at 4 °C
Primers (10 µM)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT Section 7.1
K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT Section 7.1
PCR fragment from yeast genomic DNA as a template  for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                  rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT Section 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT Section 7.1
Equipment
Coffee grinder Gastroback 42601 Section 4
Dewar flask NAL GENE 4150-2000 Section 3
DynaMag TM-2 magnetic rack Invitrogen 12321D Section 4, 5 and 6
Hybridization oven Hybaid Mini10 Ri418 Section 2
Microcentrifuge Eppendorf 5424R Section 4 and 7.1
UV-crosslinker Analytikjena 95-0174-02 Section 7.1

References

  1. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
  2. Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
  3. Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542 (2018).
  4. Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
  5. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
  6. Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674 (2015).
  7. Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430 (2010).
  8. Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
  9. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
  10. Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111 (2017).
  11. Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
  12. Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2 (2014).
  13. Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045 (2023).
  14. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  16. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  17. Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023)
  18. Vermeulen, M., Déjardin, J. Locus-specific chromatin isolation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).

Play Video

Cite This Article
Sajid, A., Hamperl, S. Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (201), e65460, doi:10.3791/65460 (2023).

View Video