Summary

Purificazione della cromatina del locus genico a copia singola in Saccharomyces cerevisiae

Published: November 17, 2023
doi:

Summary

Questo protocollo presenta un metodo di isolamento della cromatina locus-specifico basato sulla ricombinazione sito-specifica per purificare un locus genico a singola copia di interesse nel suo contesto nativo della cromatina dal lievito in gemmazione, Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

L’unità organizzativa di base della cromatina eucariotica è la particella del nucleo del nucleosoma (NCP), che comprende il DNA avvolto ~ 1,7 volte attorno a un ottamero istone. La cromatina è definita come l’entità degli NCP e di numerosi altri complessi proteici, compresi i fattori di trascrizione, il rimodellamento della cromatina e gli enzimi modificanti. Non è ancora chiaro come queste interazioni proteina-DNA siano orchestrate a livello di specifici loci genomici durante le diverse fasi del ciclo cellulare. Ciò è dovuto principalmente alle attuali limitazioni tecniche, che rendono difficile ottenere misurazioni precise di tali interazioni dinamiche. Qui, descriviamo un metodo migliorato che combina la ricombinazione sito-specifica con un efficiente protocollo di purificazione di affinità in un’unica fase per isolare un locus genico di interesse a singola copia nel suo stato nativo della cromatina. Il metodo consente l’arricchimento robusto del locus bersaglio sulla cromatina genomica, rendendo questa tecnica una strategia efficace per identificare e quantificare le interazioni proteiche in modo imparziale e sistematico, ad esempio mediante spettrometria di massa. A seguito di tali analisi composizionali, la cromatina nativa purificata con questo metodo riflette probabilmente la situazione in vivo per quanto riguarda il posizionamento dei nucleosomi e le modificazioni degli istoni ed è, quindi, suscettibile di ulteriori analisi strutturali e biochimiche della cromatina derivata praticamente da qualsiasi locus genomico nel lievito.

Introduction

L’organizzazione dinamica dei genomi eucariotici in cromatina compatta il DNA per adattarsi ai confini del nucleo, garantendo al contempo una dinamica sufficiente per l’espressione genica e l’accessibilità per i fattori regolatori. In parte, questa versatilità è mediata dal nucleosoma, l’unità di base della cromatina, che comprende una particella centrale con 147 bp di DNA avvolto ~1,7 volte attorno all’ottameroistonico 1. Il nucleosoma è una struttura altamente dinamica per quanto riguarda la sua composizione, con numerose varianti istoniche e modificazioni post-traduzionali (PTM) sulle code istoniche N- e C-terminali. Inoltre, la cromatina eucariotica interagisce con una moltitudine di altri componenti essenziali, come i fattori di trascrizione, i macchinari per l’elaborazione del DNA e dell’RNA, le proteine architettoniche, gli enzimi coinvolti nel rimodellamento e nella modifica della cromatina e le molecole di RNA associate alla cromatina. Questi macchinari cruciali coinvolti nella trascrizione, nella replicazione e nella riparazione richiedono tutti l’accesso alla cromatina, che funge da substrato naturale per questi processi. Di conseguenza, la comprensione dei meccanismi molecolari alla base di queste transazioni del DNA richiede una definizione precisa delle alterazioni collettive nella struttura della cromatina nelle specifiche regioni genomiche in cui questi meccanismi convergono e facilitano le reazioni biologiche.

Nonostante l’identificazione di numerosi fattori della cromatina attraverso la genetica e gli studi di interazione proteina-proteina, l’esecuzione di analisi dirette, imparziali e complete delle interazioni della cromatina in particolari siti genomici è rimasta un ostacolo significativo 2,3. Inizialmente, solo regioni altamente abbondanti del genoma (cioè loci ripetitivi) o plasmidi multi-copia potevano essere isolati in quantità e purezza sufficienti per l’identificazione spettrometrica di massa delle proteine associate 4,5,6,7. Una serie di nuovi approcci basati sull’ibridazione diretta di sonde di cattura con DNA cromatinizzato, sulla biotinilazione di prossimità utilizzando il sistema CRISPR-dCas9 o sul legame di proteine adattatrici sequenza-specifiche al locus di interesse hanno iniziato a svelare il proteoma di loci a singola copia da genomi di lieviti e mammiferi 8,9,10. Tuttavia, tutti questi metodi richiedono la reticolazione della formaldeide per stabilizzare le interazioni proteina-DNA e la sonicazione per solubilizzare la cromatina per la successiva purificazione. Insieme, entrambe le manipolazioni escludono la possibilità di successivi studi strutturali e funzionali della cromatina purificata.

Per superare queste limitazioni, abbiamo precedentemente ideato una metodologia che impiega la ricombinazione sito-specifica per estrarre domini cromosomici mirati dal lievito11,12. In sostanza, la regione genomica di interesse è circondata da siti di riconoscimento (RS) per la R-ricombinasi sito-specifica di Zygosaccharomyces rouxi, incorporando contemporaneamente un gruppo di tre siti di legame al DNA per la proteina LexA repressore trascrizionale procariotica (LexA) all’interno della stessa regione. Le cellule di lievito contengono una cassetta di espressione per l’espressione simultanea di R-ricombinasi e una proteina LexA fusa a un tag di purificazione di affinità tandem (TAP). Dopo l’induzione della R-ricombinasi, l’enzima asporta in modo efficiente la regione bersaglio dal cromosoma sotto forma di un dominio cromatinico circolare. Questo dominio può essere purificato tramite la proteina adattatore LexA-TAP, che si lega ai siti di legame del DNA LexA, nonché a un supporto di affinità. Questo metodo è stato recentemente utilizzato per isolare domini cromatinici distinti contenenti origini di replicazione selezionate del cromosoma III13 del lievito.

Uno dei principali vantaggi di questo approccio ex vivo è che consente analisi funzionali del materiale isolato. Ad esempio, i domini di origine della replicazione purificati con questo metodo possono essere sottoposti a saggi di replicazione in vitro per valutare l’efficienza della cottura dell’origine in una provetta da modelli di cromatina assemblati nativi in vivo . In definitiva, la caratterizzazione biochimica e funzionale del materiale isolato può consentire la ricostituzione di processi nucleari utilizzando proteine purificate insieme al modello di cromatina nativa. In sintesi, questa metodologia apre una strada entusiasmante nella ricerca sulla cromatina, in quanto sarà possibile seguire i cambiamenti compositivi e strutturali della cromatina collettiva di una specifica regione genomica che subisce una certa transazione cromosomica.

Protocol

Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e gli strumenti utilizzati in questo protocollo. Vedere la Tabella 1 per un elenco delle soluzioni, dei buffer e dei supporti utilizzati. 1. Costruzione del ceppo di lievito ricombinante Per costruire un ceppo di lievito competente per la ricombinazione, trasformare il plasmide K238 digerito da SbfI in un ceppo di lievito con siti di legame LexA integrati e s…

Representative Results

La purificazione del dominio della cromatina ARS316 di ~1,4 kb è stata mediata dalla proteina adattatore LexA-TAP espressa costitutivamente. Per fungere da controllo negativo, abbiamo condotto purificazioni utilizzando un ceppo isogenico che esprime LexA-TAP ma non contiene RS integrati e siti di legame LexA. La Figura 3 illustra il risultato dell’analisi del DNA di un esperimento di purificazione standard eseguito sia sul ceppo di controllo che su un ceppo competente per la ricombinazione …

Discussion

L’identificazione dei fattori e del paesaggio cromatinico di una specifica regione genomica bersaglio continua a rappresentare una sfida importante nella ricerca sulla cromatina18. Questo protocollo descrive un sistema efficiente per asportare e purificare in modo specifico domini cromatinici distinti dai cromosomi del lievito. Per quanto ne sappiamo, la purezza e la resa di questa purificazione in un’unica fase superano molti dei limiti dei metodi di purificazione della cromatina locus-specifici,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro nel laboratorio S.H. è stato sostenuto dal DFG attraverso SFB1064 (ID progetto 213249687), il Consiglio europeo della ricerca (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) e la Helmholtz Gesellschaft.

Materials

Yeast strains
Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see references 13 and 14
Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see reference 13 and 14
Plasmid
K238 plasmid Section 1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
K071 Spike-in plasmid DNA Section 7.1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
Reagents
Acetone Carl Roth 5025.1 Section 2
Storage: Store at room temperature
Ammonium acetate (NH4Ac) Sigma Aldrich A7262 Section 6 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Ammonium solution (NH4OH) 25% Merck Millipore 533003 Section 6
Storage: Store at room temperature
Ammonium sulfate Santa Cruz Sc-29085 Section 2
Storage: Store at room temperature
Bacto agar BD (VWR) 90000-760 Section 3
Storage: Store at room temperature
Bacto peptone BD (VWR) 211820 Section 3
Storage: Store at room temperature
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 07604 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Chemiluminescent substrate kit ThermoFisher 34580 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate Merck 1.06579.1000 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher 15508013 Section 4
Storage: Store at 4 °C
Ethanol Merck 100983 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Galactose (20% (w/v) stock) Sigma Aldrich G0625-1KG  /  5KG Section 3
Storage: Store at room temperature
Gel loading dye (6x) BioLabs B7024A Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Glusose Sigma-Aldrich G8270 Section
Storage: Store at room temperature
Glycine Carl Roth .0079.4 Section 2
Storage: Store at room temperature
Glycogen (5 mg/mL) Invitrogen AM9510 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl) PanReac AppliChem 182109.1211 Section 2, 4 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Magnesium Acetate (MgAc) Bernd Kraft 15274.2600/C035 Section 4
Storage: Store at room temperature
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma Aldrich M8266 Section 6
Storage: Store at room temperature
Nu PAGE LDS sample buffer (4x) Invitrogen 2399549 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) Invitrogen 15593-031 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
Potassium chloride (KCl) Sigma P9541 Section 4
Storage: Store at room temperature
Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) Hartmann Analytic SRP-203 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
RadPrime labeling system ThermoFisher 18428-011 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Raffinose (20% (w/v) stock) SERVA 34140.03 Section 3
Storage: Store at room temperature
Sodium chloride (NaCl) Merck K53710504142 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium citrate (Na3C6H5O7) Sigma-Aldrich 71402 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) Alfa Aesar A11183 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 71496 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium azide Santa Cruz Biotechnology sc-208393 Section 2
Storage: Store at -20 °C
 Triethylamine Sigma Aldrich 90340 Section 2
Storage: Store at room temperature
Tris base Chem Cruz SC-3715B Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Tween-20 Bernd Kraft 18014332 Section 4
Storage: Store at room temperature
Yeast extract BD (VWR) 212720 Section 3
Storage: Store at room temperature
Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock )  Biomol Y2016.5 Section 3
Storage: Store at -20 °C
Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE Sigma Aldrich Y1376 Section 1, see reference 14
Enzymes
HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) NEB R0105S Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) ThermoFisher Scientific 78446 Section 4
Storage: Store at4 °C
Proteinase K (10 mg/mL) SERVA 33756 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
RNase A (10 mg/mL)  ThermoFisher EN0531 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
TEV protease (10000 U/µL) NEB P8112S Section 5
Storage: Store at -20 °C
Materials
BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads Bioclone Inc. FC-102 Section 2
Storage: Store at 4 °C
Dry ice Section 4
Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL Eppendorf 22431102 Section 4
Microspin G-25 Columns Cytiva 27-5325-01 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Parafilm Merck P7793 Section 4
Positive nylon membrane Biozol 11MEMP0001 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
PVDF transfer membrane Immobilon-Merck Millipore IPVH00010 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) Invitrogen  NP0336BOX Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Syringe (25 mL) with luer fitting Henke Sass Wolf 4200-000V0 Section 3
Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) Cytiva 3030-917 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Antibodies
Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody Merck Millipore 06-719 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate Invitrogen G21234 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins Sigma Aldrich P1291-500UL Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Rabbit IgG antibodies Sigma I5006-100MG Section 2
Storage: Store at 4 °C
Primers (10 µM)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT Section 7.1
K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT Section 7.1
PCR fragment from yeast genomic DNA as a template  for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                  rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT Section 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT Section 7.1
Equipment
Coffee grinder Gastroback 42601 Section 4
Dewar flask NAL GENE 4150-2000 Section 3
DynaMag TM-2 magnetic rack Invitrogen 12321D Section 4, 5 and 6
Hybridization oven Hybaid Mini10 Ri418 Section 2
Microcentrifuge Eppendorf 5424R Section 4 and 7.1
UV-crosslinker Analytikjena 95-0174-02 Section 7.1

References

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Cite This Article
Sajid, A., Hamperl, S. Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (201), e65460, doi:10.3791/65460 (2023).

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