Produção e análise otimizadas de vesículas cheias de proteína recombinante de E. coli

O trabalho bacteriano realizado segue as regulamentações locais, nacionais e internacionais de contenção de biossegurança adequadas ao nível de risco de biossegurança particular de cada cepa. 1. Seleção de diferentes VNps Identifique as sequências VNp.NOTA: Para o presente estudo, foram identificadas três sequências de VNp1 que resultam em rendimento máximo e exportação vesicular das proteínas examinadas até o momento: VNp2, VNp6 e VNp15. Atualmente, não está claro por que certas variantes do VNp funcionam de forma mais eficiente com algumas proteínas do que outras; portanto, recomenda-se que sejam geradas fusões entre uma nova proteína de interesse com cada variante do VNp (i.e., VNp2, 6 ou 15).VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLVNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEAAEKTKEGVMVNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEPlasmídeos que permitem a expressão da proteína de interesse com diferentes fusões de VNp amino terminais foram disponibilizados comercialmente (ver Tabela de Materiais). Projetar uma estratégia de clonagem para inserir o gene de interesse na extremidade 3′ do cDNA que codifica para o VNp em uma dessas construções, ou adaptar um plasmídeo existente integrando o cDNA de VNp sintetizado a montante do primeiro códon ATG do gene que codifica para a proteína de interesse. Use os métodos descritos em1. Para proteínas tóxicas, use um vetor com um promotor de expressão repressível ou um promotor com mínimo ruído de expressão não induzido. Clone o tag de sequência VNp no amino-terminal da proteína de fusão. Certifique-se de que as etiquetas de afinidade, sequências de clivagem de protease, etc., e a proteína de interesse estejam localizadas no lado carboxila da etiqueta VNp. Recomenda-se separar o VNp do peptídeo a jusante com uma região ligante flexível, como duas ou três repetições de uma sequência polipeptídica -G-G-S-G- (Figura 1).NOTA: Use plasmídeos com uma seleção de antibióticos que não tem como alvo o peptidoglicano, o que enfraquece a superfície celular e reduz o rendimento da vesícula. Kanamicina e cloranfenicol (ver Tabela de Materiais) foram os antibióticos preferidos utilizados para este estudo. 2. Cultura de células bacterianas e indução de proteínas NOTA: As estirpes bacterianas normalmente utilizadas neste protocolo são Escherichia coli BL21 (DE3) ou W3110. As células de E. coli são cultivadas em caldo lisogênico (LB) (10 g/L triptona; 10 g/L NaCl; 5 g/L extrato de levedura) ou caldo fantástico (TB) (12 g/L triptona; 24 g/L extrato de levedura; 4 mL/L 10% glicerol; 17 mM KH 2 PO 4; 72 mM K2HPO4, sais autoclavados separadamente) (ver Tabela de Materiais). Imagens de exemplo mostrando cada etapa da indução da proteína e subsequente processo de isolamento e purificação são mostradas na Figura 2. Cultivar 5 mL de LB a partir de transformações bacterianas frescas a 37 °C até a saturação e utilizá-los para inocular 25 mL de TB em um frasco cônico de 500 mL, todos com seleção adequada de antibióticos. A relação superfície:volume é um fator importante na otimização deste sistema. Utilizar um frasco de volume tão grande quanto possível (por exemplo, frasco de 5 L contendo 1 L de cultura; para ensaios de otimização, utilizar 25 ml de meio num frasco de 500 ml). Incubar as culturas de frascos de agitação maiores numa estufa a 37 °C com agitação a 200 rpm (lançamento orbital de ≥25 mm) até atingir um valor de densidade óptica de 600 nm (OD600) de 0,8-1,0.NOTA: A vesiculação é ideal quando as células são cultivadas a 37 °C. Entretanto, algumas proteínas recombinantes requerem expressão em temperaturas mais baixas. Se este for o caso da proteína de interesse, o tag VNp6 deve ser usado, pois isso permite a exportação de vesículas de alto rendimento em temperaturas de até 25 °C. Para induzir a expressão de proteínas recombinantes do promotor T7, adicionar isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a uma concentração final de até 20 μg/mL (84 μM) (ver Tabela de Materiais). A indução da expressão de proteínas recombinantes deve ocorrer na fase logarítmica tardia (isto é, OD600 típica de 0,8-1,0) para a produção de vesículas.NOTA: A duração do período de indução pode diferir entre as proteínas, com algumas atingindo a produção máxima em 4 h e outras durante a noite (18 h). Até à data, a exportação máxima de vesículas foi obtida em culturas nocturnas. 3. Isolamento de vesículas recombinantes Pellet as células por centrifugação a 3.000 x g (4 °C) por 20 min. Para esterilizar meios contendo vesículas para armazenamento a longo prazo, passe o meio de cultura limpo através de um filtro de polietersulfona (PES) 0,45 μm estéril e sem detergente (ver Tabela de Materiais).NOTA: Para testar a exclusão de células viáveis do filtrado contendo vesículas, colocar placa em ágar LB e incubar durante a noite a 37 °C. Para concentrar as vesículas em um volume menor, passe o meio estéril contendo vesículas através de um filtro estéril e livre de detergente de 0,1 μm de ésteres mistos de celulose (MCE) (ver Tabela de Materiais). Lave suavemente a membrana com 0,5-1 mL de PBS estéril usando um raspador de células ou espalhador de plástico para remover cuidadosamente as vesículas da membrana. Transfira para um tubo de microfuga fresco.NOTA: As vesículas purificadas podem ser armazenadas em meio estéril ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 °C. Existem exemplos de proteínas recombinantes armazenadas nessas vesículas por 6 meses, desta forma, sem perda da atividade enzimática. 4. Liberação de proteínas solúveis de vesículas isoladas Uma vez que as vesículas contendo proteínas tenham sido isoladas no meio/tampão estéril, submeter as membranas lipídicas vesiculares à sonicação usando um esquema apropriado para o aparelho (por exemplo, ciclos de ligação e desativação de 6x 20 s) e centrifugação a 39.000 x g (4 °C) por 20 minutos para remover detritos vesiculares.NOTA: O choque osmótico ou o tratamento com detergente podem ser usados como uma alternativa para quebrar as vesículas, mas deve-se considerar o impacto sobre a funcionalidade da proteína e/ou a aplicação a jusante. Se a fusão de VNp permanecer citosólica e não for liberada no meio, isole a proteína usando protocolos padrão (por exemplo, ressuspender os pellets de células em 5 mL de um tampão de extração apropriado (tris 20 mM, NaCl 500 mM), sonicar e remover os restos celulares por centrifugação). 5. Determinação da concentração de proteínas Determinar a concentração de proteínas por análise de densitometria em gel de amostras triplicadas1. Executar juntamente com os padrões de carregamento de albumina de soro bovino (BSA) em géis de eletroforese em gel de poliacrilamida de poliacrilamida corados com coomassie (SDS-PAGE). Digitalize e analise os géis usando o software apropriado (por exemplo, Imagem J; ver Tabela de Materiais). 6. Visualização da formação de vesículas e vesículas isoladas por microscopia de fluorescência NOTA: Se as células contiverem marcadores de fusão ou membrana de VNp marcados fluorescentemente, a imagem de células vivas pode ser usada para acompanhar a formação de vesículas. Alternativamente, corantes lipídicos fluorescentes podem ser usados para visualizar vesículas para confirmar a produção e purificação. Montagem de célulasInduza a expressão de fusão de VNp por várias horas antes de montar na lamínula. Método da almofada de agarose (Figura 3A-C): pipetar as células para uma almofada LB-agarose circular fina (<1 mm) que foi deixada formar e colocada em uma lâmina de vidro limpa. Deixe as células se acomodarem e se equilibrarem e coloque uma tampa de 50 mm x 25 mm sobre a almofada e as células. Segure a tampa no lugar com espaçadores e fita adesiva. Método da polietilenoimina (PEI) (Figura 3D-F): espalhe 20 μL de PEI a 0,05% (em dH2O) sobre uma lamínula com ponta de pipeta e deixe por 3-5 min para se prender ao vidro sem deixar secar. Adicionar 50 μL de cultura celular e deixar por 5-10 min para garantir que as bactérias tenham se associado à superfície revestida com PEI4. Lave a tampa com 100 μL de meio antes de colocá-la na lâmina e segure-a no lugar com espaçadores e fita adesiva. Montagem de vesículasPipetar vesículas purificadas sobre uma almofada LB-agarose circular fina (<1 mm) que foi deixada formar e colocada em uma lâmina de vidro limpa. Depois de secar, coloque uma tampa de 50 mm x 25 mm sobre a almofada e as vesículas. Segure a tampa no lugar com espaçadores e fita adesiva. O corante lipídico fluorescente FM4-64 é capaz de corar membranas5 e, portanto, pode ser usado para visualizar vesículas. Adicionar FM4-64 (ver Tabela de Materiais) às vesículas purificadas a uma concentração final de 2 μM (a partir de um estoque de 2 mM dissolvido em dimetilsulfóxido [DMSO]) e imagem após uma incubação de 10 min. Isso é especialmente útil para identificar vesículas contendo cargas marcadas sem fluorescência5. Enxaguar as lamínulas com o mesmo meio utilizado para cultivar as células observadas.NOTA: Alguns meios complexos (por exemplo, TB) podem apresentar autofluorescência, o que pode resultar em excesso de sinal de fundo. Vesículas de imagemNOTA: Exemplos de imagens de microscopia de vesículas recombinantes de VNp podem ser vistos na Figura 4.Monte a lâmina em um microscópio invertido (veja Tabela de Materiais) usando uma objetiva de imersão em óleo e deixe por 2-3 min para permitir que a amostra se estabeleça e a temperatura se equilibre.NOTA: Todas as imagens de células vivas para cada amostra devem ser concluídas dentro de 30 minutos após a montagem das células em lamínulas para minimizar o impacto da fototoxicidade e do estresse anaeróbio. Por essa razão, as imagens de plano único são preferidas às pilhas z. Utilizar fontes de luz apropriadas (por exemplo, diodo emissor de luz [LED] ou lâmpada halógena; ver Tabela de Materiais) e combinações de filtros para a(s) proteína(s)/corante(s) fluorescente(s) utilizado(s)6. Use uma lente de alta ampliação (i.e., 100x ou 150x) e alta abertura numérica (i.e., NA ≥1.4) para obter imagens das células microbianas e vesículas. Determine a intensidade luminosa mínima necessária para visualizar sinais de fluorescência de células e/ou vesículas. Isso pode exigir algum ajuste das configurações de exposição e ganho para a câmera em uso.NOTA: Os tempos de exposição típicos das atuais câmeras CMOS (complementary metal-oxide semiconductor) variam entre 50-200 ms, dependendo do sistema de imagem. Para imagens de quadro único, use a média de três imagens para reduzir o ruído de fundo aleatório dependente do hardware. Para imagens de lapso de tempo, aguarde de 3 a 5 minutos entre quadros individuais.NOTA: Dependendo da configuração do microscópio, o foco pode precisar ser ajustado intermitentemente ao longo de experimentos de lapso de tempo mais longos.