大腸菌からの組換えタンパク質充填小胞の最適生産と分析

実施される細菌作業は、各菌株の特定のバイオセーフティハザードレベルに適合する、地域、国内、および国際的なバイオセーフティ封じ込め規制に従います。 1. さまざまな VNp の選択 VNp シーケンスを特定します。注:本研究では、これまでに調査されたタンパク質の最大収量と小胞輸送をもたらす3つのVNp配列1 が特定されています:VNp2、VNp6、およびVNp15。特定のVNpバリアントが一部のタンパク質で他のタンパク質よりも効率的に機能する理由は現在のところ明らかではありません。したがって、目的の新しいタンパク質と各VNpバリアント(VNp2、6、または15)との間で融合を生成することをお勧めします。VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLVNp6: MDVFKKGFSIADEGVVVGAVEKTDQGVTEAAEKTKEGVMVNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVE異なるVNpアミノ末端融合体を有する目的のタンパク質の発現を可能にするプラスミドが市販されている( 材料表参照)。 VNpをコードするcDNAの3’末端に目的の遺伝子をこれらの構築物の1つに挿入するクローニング戦略を設計するか、目的のタンパク質をコードする遺伝子の最初のATGコドンの上流に合成されたVNp cDNAを組み込むことによって既存のプラスミドを適応させます。1 で説明されている方法を使用します。 毒性タンパク質の場合は、抑制可能な発現プロモーターまたは非誘導発現ノイズが最小のプロモーターを含むベクターを使用してください。 融合タンパク質のアミノ末端にあるVNp配列タグをクローニングします。アフィニティータグ、プロテアーゼ切断配列など、および目的のタンパク質がVNpタグのカルボキシル側にあることを確認します。VNpを下流ペプチドから分離することは、-G-G-S-G-ポリペプチド配列の2つまたは3つの繰り返しなどの柔軟なリンカー領域を持つことをお勧めします(図1)。注:細胞表面を弱め、小胞収量を低下させるペプチドグリカンを標的としない抗生物質選択のプラスミドを使用してください。カナマイシンとクロラムフェニコール( 材料の表を参照)は、この研究に使用された好ましい抗生物質でした。 2. 細菌細胞培養とタンパク質誘導 注:このプロトコルで通常使用される細菌株は、大腸菌BL21(DE3)またはW3110のいずれかです。大腸菌細胞は、リソジェニーブロス(LB)(10 g/Lトリプトン;10 g/L NaCl;5 g/L酵母エキス)または素晴らしいブロス(TB)(12 g/Lトリプトン;24 g/L酵母エキス;4 mL/L 10%グリセロール;17 mM KH2PO 4;72 mMK2HPO4、塩は別々にオートクレーブ処理)培地で培養されます(材料表参照)。タンパク質誘導およびその後の単離および精製プロセスの各ステップを示すサンプル画像を図2に示します。 新鮮な細菌形質転換から5 mL LBスターターを37°Cで飽和まで培養し、それらを使用して500 mLのコニカルフラスコに25 mLのTBを接種し、すべて適切な抗生物質を選択します。 表面積:体積比は、このシステムを最適化する上で重要な要素です。できるだけ大容量のフラスコを使用してください(例:1 Lの培養液を含む5 Lフラスコ、最適化ランでは、500 mLフラスコに25 mLの培地を使用します)。 より大きな振とうフラスコ培養物を37°Cのインキュベーター内で、600 nmの光学濃度値(OD 600)が0.8〜1.0に達するまで200 rpm(≥25 mm軌道投射)で振とうしながらインキュベートします。注:細胞を37°Cで増殖させる場合、ベシキュレーションが最適です。 しかしながら、いくつかの組換えタンパク質は、より低い温度での発現を必要とする。目的のタンパク質の場合、VNp6タグを使用すると、25°Cまでの温度で高収量の小胞を輸出できるため、VNp6タグを使用する必要があります。 T7プロモーターから組換えタンパク質発現を誘導するには、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度20 μg/mL(84 μM)まで加えます( 材料表参照)。組換えタンパク質発現の誘導は、小胞の産生のために後期ログ期(すなわち、0.8〜1.0の典型的なOD600 )で起こらなければならない。注:誘導期間の長さはタンパク質によって異なる場合があり、4時間で最大産生に達するものもあれば、一晩(18時間)で最大産生に達するものもあります。今日まで、最大の小胞輸出は一晩培養で得られている。 3. 組換え小胞分離 細胞を3,000 x g (4°C)で20分間遠心分離してペレット化します。 ベシクル含有培地を滅菌して長期保存するには、透明培地を滅菌済みの界面活性剤フリーの0.45 μmポリエーテルスルホン(PES)フィルターに通します( 材料表を参照)。注:小胞含有濾液からの生細胞の排除をテストするには、LB寒天上にプレートし、37°Cで一晩インキュベートします。 ベシクルをより小さな容量に濃縮するには、滅菌ベシクル含有培地を滅菌および界面活性剤を使用しない0.1 μm混合セルロースエステル(MCE)フィルターに通します( 材料表を参照)。 セルスクレーパーまたはプラスチックスプレッダーを使用して0.5〜1 mLの滅菌PBSでメンブレンを穏やかに洗浄し、メンブレンから小胞を慎重に除去します。新しいマイクロ遠心チューブに移します。注:精製された小胞は、滅菌培地またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に4°Cで保存できます。 このようにして、酵素活性を失うことなく、これらの小胞に6ヶ月間保存された組換えタンパク質の例がある。 4. 単離された小胞からの可溶性タンパク質放出 タンパク質含有小胞が滅菌培地/緩衝液に単離されたら、装置の適切なスケジュール(例えば、6x 20秒のオンおよびオフサイクル)を使用して小胞脂質膜を超音波処理にかけ、39,000 x g (4°C)で20分間遠心分離して小胞の破片を除去します。注:浸透圧ショックまたは界面活性剤処理は、小胞を壊すための代替として使用できますが、タンパク質の機能および/または下流のアプリケーションへの影響を考慮する必要があります。 VNp融合が細胞質のままで培地に放出されない場合は、標準プロトコルを使用してタンパク質を単離します(例えば、細胞ペレットを5 mLの適切な抽出バッファー(20 mM tris、500 mM NaCl)に再懸濁し、超音波処理し、遠心分離によって細胞破片を除去します)。 5. タンパク質濃度測定 三重試料のゲル密度測定分析によりタンパク質の濃度を決定する1.ウシ血清アルブミン(BSA)ローディングスタンダードと並行して、クーマシー染色されたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲルで実行します。適切なソフトウェアを使用してゲルをスキャンし、分析します(例:Image J; 材料表を参照)。 6. 蛍光顕微鏡によるベシクル形成と単離ベシクルの可視化 注:細胞に蛍光標識されたVNp融合または膜マーカーが含まれている場合は、ライブセルイメージングを使用して小胞形成を追跡できます。あるいは、蛍光脂質色素を使用して小胞を視覚化し、産生と精製を確認することもできます。 セルマウントカバーガラスに取り付ける前に、VNp フュージョン式を数時間誘導します。 アガロースパッド法(図3A−C):細胞を薄い(<1mm)円形LBアガロース(2%)パッド上にピペットで移し、きれいなスライドガラス上にセットした。細胞が落ち着いて平衡化するのを待って、50 mm x 25 mmのカバーガラスをパッドとセルに置きます。カバーガラスをスペーサーと粘着テープで所定の位置に保持します。 ポリエチレンイミン(PEI)法(図3D-F):20μLの0.05%PEI(dH2O中)をピペットチップでカバーガラスに広げ、3〜5分間放置して乾燥させずにガラスに結合させる。50 μLの細胞培養液を加え、5〜10分間放置して、細菌がPEIコーティングされた表面4に関連していることを確認します。カバーガラスをスライドに置く前に100μLのメディアで洗い、スペーサーと粘着テープで所定の位置に保持します。 取り付け小胞精製したベシクルを薄い(<1 mm)円形LB-アガロース(2%)パッド上にピペットで固定し、きれいなスライドガラス上にセットしました。液体が乾いたら、50 mm x 25 mmのカバーガラスをパッドと小胞に置きます。カバーガラスをスペーサーと粘着テープで所定の位置に保持します。 蛍光脂質色素FM4−64は、膜5を染色することができるので、小胞を可視化するために使用することができる。FM4-64( 材料の表を参照)を精製小胞に最終濃度2 μM(ジメチルスルホキシド[DMSO]に溶解した2 mMストックから)に加え、10分間のインキュベーション後に画像化します。これは、非蛍光標識貨物5を含む小胞を同定するのに特に有用である。 観察された細胞の培養に使用したのと同じ培地でカバーガラスをすすぎます。注:一部の複雑な培地(TBなど)は自家蛍光を示すことがあり、過剰なバックグラウンドシグナルが発生する可能性があります。 イメージング小胞注:VNp組換え小胞の顕微鏡画像の例を 図4に示します。油浸対物レンズを使用してスライドを倒立顕微鏡( 材料表を参照)に取り付け、2〜3分間放置して、サンプルを沈降させ、温度を平衡化させます。注:各サンプルのすべてのライブセルイメージングは、光毒性と嫌気性ストレスの影響を最小限に抑えるために、細胞をカバーガラスに取り付けてから30分以内に完了する必要があります。このため、Z スタックよりも単一平面の画像が好まれます。 使用する蛍光タンパク質/色素に適した光源(発光ダイオード[LED]やハロゲン電球など、 材料表を参照)とフィルターの組み合わせを使用してください6. 微生物細胞および小胞のイメージングには、高倍率(すなわち、100倍または150倍)および高開口数(すなわち、NA ≥1.4)レンズを使用してください。 細胞および/または小胞からの蛍光シグナルを可視化するのに必要な最小光強度を決定する。これには、使用中のカメラの露出とゲインの設定を調整する必要がある場合があります。注:現在の相補型金属酸化膜半導体(CMOS)カメラからの典型的な露光時間は、イメージングシステムに応じて50〜200ミリ秒の間で変化します。 単一フレーム イメージの場合は、3 イメージの平均化を使用して、ハードウェアに依存するランダムなバックグラウンド ノイズを減らします。 タイムラプスイメージングの場合は、個々のフレーム間に3〜5分かかります。注:顕微鏡のセットアップによっては、長時間のタイムラプス実験中に焦点を断続的に調整する必要がある場合があります。