Optimierte Herstellung und Analyse von rekombinanten, proteingefüllten Vesikeln aus E. coli
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur bakteriellen Herstellung von rekombinanten Proteinen, einschließlich typischerweise unlöslicher oder Disulfidbrücken-haltiger Proteine, die in extrazellulären membrangebundenen Vesikeln verpackt sind. Dies hat das Potenzial, auf vielseitige Bereiche der wissenschaftlichen Forschung angewendet zu werden, einschließlich der angewandten Biotechnologie und der Medizin.
Abstract
Dieses innovative System, das einen kurzen Peptid-Tag verwendet, der mehrere rekombinante Proteine in membrangebundenen Vesikeln aus E. coli exportiert, bietet eine effektive Lösung für eine Reihe von Problemen, die mit der bakteriellen rekombinanten Proteinexpression verbunden sind. Diese rekombinanten Vesikel unterteilen Proteine in einer Mikroumgebung, die die Produktion von ansonsten schwierigen, toxischen, unlöslichen oder disulfidbrückenhaltigen Proteinen aus Bakterien erleichtert. Die Proteinausbeute ist im Vergleich zur typischen bakteriellen Expression in Abwesenheit des vesikelnukleierenden Peptid-Tags erheblich erhöht. Die Freisetzung von Vesikel-verpackten Proteinen unterstützt die Isolierung aus dem Nährmedium und ermöglicht eine langfristige aktive Proteinspeicherung. Diese Technologie führt zu einer höheren Ausbeute an vesikelverpackten, funktionellen Proteinen für eine vereinfachte nachgelagerte Verarbeitung für eine Vielzahl von Anwendungen, von der angewandten Biotechnologie bis hin zu Entdeckungswissenschaft und Medizin. Im vorliegenden Artikel und dem dazugehörigen Video wird ein detailliertes Protokoll der Methode bereitgestellt, das die wichtigsten Schritte der Methodik zur Maximierung der rekombinanten proteingefüllten Vesikelproduktion hervorhebt.
Introduction
Das gramnegative Bakterium E. coli ist ein attraktives System für die rekombinante Proteinproduktion sowohl im industriellen als auch im akademischen Maßstab. Es ist nicht nur kostengünstig und einfach, in Chargen bis zu hohen Dichten zu kultivieren, sondern es wurde auch ein breites Spektrum an Reagenzien, Stämmen, Werkzeugen und Promotoren entwickelt, um die Erzeugung funktioneller Proteine in E. coli1 zu fördern. Darüber hinaus überwinden Techniken der synthetischen Biologie nun Hindernisse, die typischerweise mit der Anwendung posttranslationaler Modifikationen und der Faltung komplexer Proteine zusammenhängen2. Die Möglichkeit, die Sekretion rekombinanter Proteine gezielt in Nährmedien zu fördern, ist attraktiv, um die Ausbeute zu verbessern und die Herstellungskosten zu senken. Die kontrollierte Verpackung von benutzerdefinierten Proteinen in Membranvesikel unterstützt die Entwicklung von Produkten und Technologien in der angewandten Biotechnologie- und Medizinindustrie. Bisher fehlte es an breit anwendbaren Methoden, um rekombinante Proteine aus E. coli 3 zu sezernieren.
Eastwood et al. haben kürzlich eine Peptid-Tagging-basierte Methode zur Herstellung und Isolierung rekombinanter proteinhaltiger Vesikel aus E. colientwickelt 1. Dieses Vesikel-Nukleating-Peptid (VNp) ermöglicht die Herstellung extrazellulärer bakterieller Membranvesikel, in die das rekombinante Protein der Wahl gezielt eingesetzt werden kann, um die Reinigung und Lagerung des Zielproteins zu vereinfachen, und ermöglicht deutlich höhere Ausbeuten als normalerweise aus Schüttelkolbenkulturen. Es wurden Ausbeuten von fast 3 g rekombinantem Protein pro Liter Kolbenkultur berichtet, wobei die Ausbeuten >100-mal höher waren als bei äquivalenten Proteinen ohne VNp-Tag. Diese rekombinanten, mit Proteinen angereicherten Vesikel können schnell aus den Nährmedien gereinigt und konzentriert werden und bieten eine stabile Umgebung für die Lagerung. Diese Technologie stellt einen großen Durchbruch in der Produktion von rekombinanten E. coli-Proteinen dar . Die Vesikel kompartimentieren toxische und disulfidbrückenhaltige Proteine in löslicher und funktioneller Form und unterstützen die einfache, effiziente und schnelle Reinigung von vesikelverpackten, funktionellen Proteinen für die Langzeitlagerung oder die direkte Verarbeitung1.
Die wichtigsten Vorteile, die diese Technologie gegenüber den derzeitigen Techniken bietet, sind: (1) die Anwendbarkeit auf eine Reihe von Größen (1 kDa bis >100 kDa) und Proteintypen; (2) Erleichterung der Bildung von Disulfidbrücken zwischen und innerhalb von Proteinen; (3) anwendbar auf Multiproteinkomplexe; (4) kann mit einer Reihe von Promotoren und Standard-Labor-E. coli-Stämmen verwendet werden; (5) die Erzeugung von Proteinausbeuten aus Schüttelkolben, die normalerweise nur bei Fermentationskulturen zu beobachten sind; Proteine werden exportiert und in membrangebundene Vesikel verpackt, die (6) eine stabile Umgebung für die Lagerung des aktiven löslichen Proteins bieten; und (7) vereinfacht die nachgeschaltete Verarbeitung und Proteinreinigung. Dieses einfache und kostengünstige Werkzeug für rekombinante Proteine wird sich wahrscheinlich positiv auf die Biotechnologie- und Medizinbranche sowie auf die Entdeckungswissenschaft auswirken.
Hier beschreibt ein detailliertes, über mehrere Jahre entwickeltes Protokoll die optimalen Bedingungen, um mit der VNp-Technologie rekombinante proteingefüllte Vesikel aus Bakterien herzustellen. Es werden Beispielbilder dieses Systems in der Praxis gezeigt, wobei ein fluoreszierendes Protein exprimiert wird, wodurch das Vorhandensein von Vesikeln in verschiedenen Phasen der Produktion, Reinigung und Konzentration visualisiert werden kann. Abschließend wird eine Anleitung gegeben, wie die Bildgebung lebender Zellen zur Validierung der Produktion von VNp-fusionshaltigen Vesikeln aus den Bakterien verwendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die oben beschriebene aminoterminale Peptid-markierte Methode zur Herstellung rekombinanter Proteine ist ein einfacher Prozess, der konstant große Mengen an Protein liefert, die effizient isoliert und/oder monatelang gelagert werden können.
Es ist wichtig, die wichtigsten Schritte im Protokoll hervorzuheben, die für eine optimale Nutzung dieses Systems erforderlich sind. Zuerst muss der VNp-Tag1 am N-Terminus lokalisiert werden, gefolgt von dem interessierenden Protein und den entsprechenden Tags. Es ist auch wichtig, den Einsatz von Antibiotika zu vermeiden, die auf die Peptidoglykanschicht abzielen, wie z. B. Ampicillin.
In Bezug auf die Wachstumsbedingungen sind Rich Media (z. B. LB- oder TB-Medien) und ein hohes Oberflächen-Volumen-Verhältnis erforderlich, um die Vesikelproduktion zu maximieren. Die optimale Temperatur für die Produktion extrazellulärer Vesikel beträgt 37 °C, aber auch die Bedingungen, die typischerweise für die Expression des interessierenden Proteins erforderlich sind, müssen berücksichtigt werden. Für niedrigere Induktionstemperaturen muss VNp6 verwendet werden. Entscheidend ist, dass die Induktion des T7-Promotors mit nicht mehr als 20 μg/ml (84 μM) IPTG erreicht werden muss, sobald die Zellen einen OD600 von 0,8-1,0 erreichen. Proteine, die mit dem System exprimiert werden, erreichen die maximale Vesikelproduktion entweder nach 4 Stunden oder nach Induktion über Nacht.
Trotz der Einfachheit dieses Protokolls muss es optimiert werden. Die Fusion von VNp-Varianten, die Expressionstemperaturen und die Induktionszeiten können je nach interessierendem Protein unterschiedlich sein. Darüber hinaus besteht die Notwendigkeit, die Reinigung und anschließende Konzentration der extrazellulären Vesikel aus den Medien zu optimieren. Das aktuelle Verfahren ist nicht skalierbar und kann zeitaufwändig sein. Dies sind die Grenzen dieser Methodik.
Die VNp-Technologie hat viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden2. Es ermöglicht den vesikulären Export verschiedener Proteine, wobei die maximale Größe, die bisher erfolgreich exprimiert wurde, 175 kDa für Vesikel liegt, die intern bleiben, und 85 kDa für diejenigen, die exportiert werden. Darüber hinaus kann diese Technologie die Ausbeute an rekombinanten Proteinen mit einer Reihe von physikalischen Eigenschaften und Aktivitäten erheblich steigern. Exportierte Vesikel, die das interessierende Protein enthalten, können durch einfache Filtration aus dem vorgereinigten Medium isoliert und anschließend in sterilen Nährmedien oder Puffern bei 4 °C für mehrere Monate gelagert werden.
Die Anwendungen für dieses System sind vielfältig und reichen von der Entdeckungswissenschaft über die angewandte Biotechnologie bis hin zur Medizin (z. B. durch die Herstellung funktioneller Therapeutika)3. Die einfache Herstellung, die Weiterverarbeitung und die hohe Ausbeute sind attraktive Eigenschaften in diesen Bereichen und insbesondere in der Industrie.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken verschiedenen Twitter-Nutzern, die Fragen zu dem Protokoll gestellt haben, das in dem Artikel zur Beschreibung der VNp-Technologie vorgestellt wird. Abbildung 1A wurde unter Verwendung von Symbolen aus flaticon.com generiert. Diese Arbeit wurde von der University of Kent unterstützt und vom Biotechnology and Biological Sciences Research Council finanziert (BB/T008/768/1 und BB/S005544/1).
Materials
| Ampicillin | Melford | 69-52-3 | |
| Chloramphenicol | Acros Organics (Thermofisher Scientific) | 56-75-7 | |
| E. coli BL21 (DE3) | Lab Stock | N/A | |
| E. coli DH10β | Lab Stock | N/A | |
| Filters for microscope | Chroma | ||
| FM4-64 | Molecular Probes (Invitrogen) | T-3166 | Dissolved in DMSO, stock concentration 2 mM |
| ImageJ | Open Source | Downloaded from: https://imagej.net/ij/index.html | |
| Inverted microscope | Olympus | ||
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Melford | 367-93-1 | |
| Kanamycin sulphate | Gibco (Thermofisher Scientific) | 11815-024 | |
| LED light source for micrscope | Cairn Research Ltd | ||
| Lysogeny Broth (LB) / LB agar | Lab Stock | N/A | 10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Yeast Extract (1.5 g/L agar) |
| Metamorph imaging software | Molecular Devices | ||
| MF-Millipore Membrane filter (0.1 µm, MCE) | Merck | VCWP04700 | |
| Millipore Express PLUS membrane filter (0.45 µm, PES) | Merck | HPWP04700 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lab Stock | N/A | |
| Plasmids allowing expression of protein of interest with different VNp amino terminal fusions | Addgene | https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/ | |
| Terrific Broth (TB) | Lab Stock | N/A | 12 g/L Tryptone; 24 g/L Yeast Extract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4 |
References
- Eastwood, T. A., et al. High-yield vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli. Cell Reports Methods. 3 (2), 100396 (2023).
- Makino, T., Skretas, G., Georgiou, G. Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria. Microbial Cell Factories. 10, 32 (2011).
- Peng, C., et al. Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: Signal peptide and beyond. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 139 (2019).
- Lewis, K., Klibanov, A. M. Surpassing nature: rational design of sterile-surface materials. Trends in Biotechnology. 23 (7), 343-348 (2005).
- Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. Imaging exocytosis and endocytosis. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 365-371 (1996).
- Mulvihill, D. P. Live cell imaging in fission yeast. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (10), (2017).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PloS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Periz, J., et al. A highly dynamic F-actin network regulates transport and recycling of micronemes in Toxoplasma gondii vacuoles. Nature Communications. 10 (1), 4183 (2019).
- Qiu, H., et al. Uniform patchy and hollow rectangular platelet micelles from crystallizable polymer blends. Science. 352 (6286), 697-701 (2016).
