Produzione e analisi ottimizzate di vescicole ricombinanti piene di proteine da E. coli

Il lavoro batterico intrapreso segue le normative locali, nazionali e internazionali di contenimento della biosicurezza che si addicono al particolare livello di pericolo di biosicurezza di ciascun ceppo. 1. Selezione di reti virtuali diverse Identificare le sequenze di reti virtuali.NOTA: Per il presente studio, sono state identificate tre sequenze VNp1 che determinano la massima resa e l’esportazione vescicolare delle proteine esaminate fino ad oggi: VNp2, VNp6 e VNp15. Attualmente non è chiaro perché alcune varianti di VNp funzionino in modo più efficiente con alcune proteine rispetto ad altre; pertanto, si raccomanda di generare fusioni tra una nuova proteina di interesse con ogni variante di VNp (ad esempio, VNp2, 6 o 15).VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLVNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEAAEKTKEGVMVNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEI plasmidi che consentono l’espressione della proteina di interesse con diverse fusioni di aminoacidi terminali VNp sono stati resi disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali). Progettare una strategia di clonazione per inserire il gene di interesse all’estremità 3′ del cDNA che codifica per la VNp in uno di questi costrutti, o adattare un plasmide esistente integrando il cDNA sintetizzato della VNp a monte del primo codone ATG del gene che codifica per la proteina di interesse. Utilizzare i metodi descritti alpunto 1. Per le proteine tossiche, utilizzare un vettore con un promotore di espressione repressibile o un promotore con rumore di espressione non indotto minimo. Clonare il tag della sequenza VNp nel terminale amminico della proteina di fusione. Assicurarsi che i tag di affinità, le sequenze di scissione della proteasi e così via e la proteina di interesse si trovino sul lato carbossilico del tag VNp. Si consiglia di separare la VNp dal peptide a valle con una regione linker flessibile, ad esempio due o tre ripetizioni di una sequenza polipeptidica -G-G-S-G- (Figura 1).NOTA: Utilizzare plasmidi con una selezione antibiotica che non ha come bersaglio il peptidoglicano, che indebolisce la superficie cellulare e riduce la resa delle vescicole. Kanamicina e cloramfenicolo (vedi Tabella dei materiali) sono stati gli antibiotici preferiti utilizzati per questo studio. 2. Coltura cellulare batterica e induzione proteica NOTA: I ceppi batterici tipicamente utilizzati in questo protocollo sono Escherichia coli BL21 (DE3) o W3110. Le cellule di E. coli sono coltivate in terreni di brodo lisogeno (LB) (10 g/L di triptone; 10 g/L di NaCl; 5 g/L di estratto di lievito) o in un fantastico brodo (TB) (12 g/L di triptone; 24 g/L di estratto di lievito; 4 mL/L 10% glicerolo; 17 mM KH 2 PO 4; 72mM K2HPO4, sali autoclavati separatamente) (vedi Tabella dei materiali). Immagini di esempio che mostrano ogni fase dell’induzione proteica e il successivo processo di isolamento e purificazione sono mostrate nella Figura 2. Coltura di 5 mL LB starter da trasformazioni batteriche fresche a 37 °C fino alla saturazione e utilizzarli per inoculare 25 mL di TB in un matraccio conico da 500 ml, il tutto con un’appropriata selezione antibiotica. Il rapporto superficie:volume è un fattore importante nell’ottimizzazione di questo sistema. Utilizzare un matraccio di volume il più grande possibile (ad esempio, un matraccio da 5 litri contenente 1 L di coltura; per le tirature di ottimizzazione, utilizzare 25 ml di terreno in un matraccio da 500 ml). Incubare le colture di matraccio di agitazione più grandi in un’incubatrice a 37 °C agitando a 200 giri/min (≥25 mm di lancio orbitale) fino a raggiungere un valore di densità ottica di 600 nm (OD600) di 0,8-1,0.NOTA: La vescicolazione è ottimale quando le cellule vengono coltivate a 37 °C. Tuttavia, alcune proteine ricombinanti richiedono espressione a temperature più basse. Se questo è il caso della proteina di interesse, deve essere utilizzato il tag VNp6, in quanto ciò consente l’esportazione di vescicole ad alto rendimento a temperature fino a 25 °C. Per indurre l’espressione proteica ricombinante dal promotore T7, aggiungere isopropile β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) ad una concentrazione finale fino a 20 μg/mL (84 μM) (vedere Tabella dei materiali). L’induzione dell’espressione proteica ricombinante deve avvenire nella fase tardiva (cioè OD600 tipico di 0,8-1,0) per la produzione di vescicole.NOTA: La durata del periodo di induzione può differire tra le proteine, con alcune che raggiungono la massima produzione a 4 ore e altre durante la notte (18 ore). Ad oggi, la massima esportazione di vescicole è stata ottenuta in colture notturne. 3. Isolamento delle vescicole ricombinanti Pellettare le celle mediante centrifugazione a 3.000 x g (4 °C) per 20 minuti. Per sterilizzare i terreni contenenti vescicole per la conservazione a lungo termine, far passare i terreni di coltura eliminati attraverso un filtro in polietersulfone (PES) sterile e privo di detergenti (vedi Tabella dei materiali).NOTA: Per verificare l’esclusione di cellule vitali dal filtrato contenente vescicola, placcare su agar LB e incubare per una notte a 37 °C. Per concentrare le vescicole in un volume più piccolo, far passare il mezzo sterile contenente vescicola attraverso un filtro sterile e privo di detergenti da 0,1 μm di esteri misti di cellulosa (MCE) (vedere Tabella dei materiali). Lavare delicatamente la membrana con 0,5-1 ml di PBS sterile utilizzando un raschietto cellulare o uno spargitore di plastica per rimuovere accuratamente le vescicole dalla membrana. Trasferire in un tubo di microfuge fresco.NOTA: Le vescicole purificate possono essere conservate in mezzi sterili o in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) a 4 °C. Ci sono esempi di proteine ricombinanti immagazzinate in queste vescicole per 6 mesi, in questo modo, senza perdita di attività enzimatica. 4. Rilascio di proteine solubili da vescicole isolate Una volta che le vescicole contenenti proteine sono state isolate nel mezzo sterile/tampone, sottoporre le membrane lipidiche vescicolari alla sonicazione utilizzando uno schema appropriato per l’apparecchio (ad esempio, cicli di accensione e spegnimento 6x 20 s) e centrifugare a 39.000 x g (4 °C) per 20 minuti per rimuovere i detriti delle vescicole.NOTA: Lo shock osmotico o il trattamento detergente possono essere utilizzati come alternativa per aprire le vescicole, ma è necessario considerare l’impatto sulla funzionalità proteica e/o sull’applicazione a valle. Se la fusione di VNp rimane citosolica e non viene rilasciata nei media, isolare la proteina utilizzando protocolli standard (ad esempio, risospendere i pellet cellulari in 5 ml di un tampone di estrazione appropriato (20 mM tris, 500 mM NaCl), sonicare e rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione). 5. Determinazione della concentrazione proteica Determinare la concentrazione di proteine mediante analisi densitometrica su gel di campioni triplicati1. Eseguire insieme agli standard di caricamento dell’albumina sierica bovina (BSA) su gel di elettroforesi su gel di dodecil-solfato di sodio colorato con coomassie (SDS-PAGE). Scansionare e analizzare i gel utilizzando un software appropriato (ad esempio, Immagine J; vedi Tabella dei materiali). 6. Visualizzazione della formazione di vescicole e vescicole isolate mediante microscopia a fluorescenza NOTA: Se le cellule contengono marcatori di fusione o membrana VNp marcati in modo fluorescente, è possibile utilizzare l’imaging di cellule vive per seguire la formazione di vescicole. In alternativa, i coloranti lipidici fluorescenti possono essere utilizzati per visualizzare le vescicole per confermare la produzione e la purificazione. Montaggio a celleIndurre l’espressione di fusione della rete virtuale per diverse ore prima di essere montato sul vetrino. Metodo del tampone di agarosio (Figura 3A-C): pipettare le cellule su un sottile (<1 mm), circolare LB-agarosio (2%) che è stato lasciato formare e impostare su un vetrino pulito. Lasciare che le celle si depositino ed equilibrarsi e posizionare un coprislip di 50 mm x 25 mm sul pad e sulle celle. Tenere il coprislip in posizione con distanziali e nastro adesivo. Metodo del polietilenimmina (PEI) (Figura 3D-F): distribuire 20 μL di PEI allo 0,05% (in dH2O) su un vetrino con punta di pipetta e lasciare legare per 3-5 minuti al vetro senza lasciare asciugare. Aggiungere 50 μL di coltura cellulare e lasciare agire per 5-10 minuti per assicurarsi che i batteri si siano associati alla superficie rivestita di PEI4. Lavare il vetrino con 100 μL di supporto prima di posizionarlo sul vetrino e tenerlo in posizione con distanziali e nastro adesivo. Vescicole di montaggioVescicole purificate con pipetta su un sottile tampone circolare LB-agarosio (2%) (<1 mm) che è stato lasciato formare e impostare su un vetrino pulito. Una volta che il liquido si è asciugato, posizionare un coprislip di 50 mm x 25 mm sul tampone e sulle vescicole. Tenere il coprislip in posizione con distanziali e nastro adesivo. Il colorante lipidico fluorescente FM4-64 è in grado di colorare le membrane5 e quindi può essere utilizzato per visualizzare le vescicole. Aggiungere FM4-64 (vedere Tabella dei materiali) alle vescicole purificate ad una concentrazione finale di 2 μM (da uno stock di 2 mM disciolto in dimetilsolfossido [DMSO]) e ottenere l’immagine dopo un’incubazione di 10 minuti. Ciò è particolarmente utile per identificare le vescicole contenenti carichi marcati in modo non fluorescente5. Risciacquare i vetrini con lo stesso mezzo utilizzato per coltivare le cellule osservate.NOTA: Alcuni mezzi complessi (ad esempio, TB) possono presentare autofluorescenza, che può causare un eccesso di segnale di fondo. Vescicole di imagingNOTA: immagini di microscopia di esempio di vescicole ricombinanti di VNp possono essere visualizzate nella Figura 4.Montare il vetrino su un microscopio invertito (vedi Tabella dei materiali) utilizzando un obiettivo ad immersione in olio e lasciare agire per 2-3 minuti per consentire al campione di depositarsi e alla temperatura di equilibrarsi.NOTA: Tutte le immagini di cellule vive per ciascun campione devono essere completate entro 30 minuti dal montaggio delle celle sui vetrini di copertura per ridurre al minimo l’impatto della fototossicità e dello stress anaerobico. Per questo motivo, le immagini a piano singolo sono preferite agli z-stack. Utilizzare sorgenti luminose appropriate (ad esempio, diodi emettitori di luce [LED] o lampadina alogena; vedi tabella dei materiali) e combinazioni di filtri per le proteine/coloranti fluorescenti utilizzate6. Utilizzare un obiettivo ad alto ingrandimento (cioè 100x o 150x) e ad alta apertura numerica (cioè NA ≥1,4) per l’imaging delle cellule microbiche e delle vescicole. Determinare l’intensità luminosa minima necessaria per visualizzare i segnali di fluorescenza provenienti da cellule e / o vescicole. Ciò potrebbe richiedere alcune regolazioni delle impostazioni di esposizione e guadagno per la fotocamera in uso.NOTA: i tempi di esposizione tipici delle attuali telecamere CMOS (Complementary Metal-Oxide Semiconductor) variano tra 50 e 200 ms a seconda del sistema di imaging. Per le immagini a fotogramma singolo, usate la media di tre immagini per ridurre il rumore di fondo casuale dipendente dall’hardware. Per l’imaging time-lapse, consentire 3-5 minuti tra i singoli fotogrammi.NOTA: A seconda della configurazione del microscopio, potrebbe essere necessario regolare la messa a fuoco in modo intermittente durante esperimenti time-lapse più lunghi.