Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Emily Jie-Ning Yang; Istvan R. Boldogh; Haojie Ji; Liza Pon; Theresa C. Swayne

doi:10.3791/65428

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Biology

Imagem de mtHyPer7, um biossensor ratiométrico para peróxido mitocondrial, em células vivas de levedura

Published: June 02, 2023

doi:

10.3791/65428

Emily Jie-Ning Yang¹, Istvan R. Boldogh^1,2, Haojie Ji², Liza Pon^1,2, Theresa C. Swayne^1,2

¹Department of Pathology and Cell Biology,Columbia University Irving Medical Center, ²Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource in the Herbert Irving Comprehensive Cancer Center,Columbia University Irving Medical Center

Summary

O peróxido de hidrogênio (H2 O₂) é uma fonte de dano oxidativo e uma molécula sinalizadora. Este protocolo descreve como medir mitocondrial H 2 O₂usando HyPer7 mitocondrial (mtHyPer7), um biossensor ratiométrico codificado geneticamente, em leveduras vivas. Ele detalha como otimizar as condições de imagem e realizar análises quantitativas celulares e subcelulares usando software disponível gratuitamente.

Abstract

A disfunção mitocondrial, ou alteração funcional, é encontrada em muitas doenças e condições, incluindo distúrbios neurodegenerativos e musculoesqueléticos, câncer e envelhecimento normal. Aqui, uma abordagem é descrita para avaliar a função mitocondrial em células de levedura vivas em resoluções celulares e subcelulares usando um biossensor ratiométrico minimamente invasivo codificado geneticamente. O biossensor, HyPer7 (mtHyPer7), detecta peróxido de hidrogênio (H 2 O₂) nas mitocôndrias. Consiste em uma sequência de sinais mitocondriais fusionados a uma proteína fluorescente circularmente permutada e o domínio H 2 O_2-responsivo de uma proteína OxyR bacteriana. O biossensor é gerado e integrado ao genoma da levedura usando um sistema CRISPR-Cas9 livre de marcadores, para uma expressão mais consistente em comparação com construções transportadas por plasmídeos.

mtHyPer7 é quantitativamente direcionado para mitocôndrias, não tem efeito detectável na taxa de crescimento de leveduras ou morfologia mitocondrial, e fornece uma leitura quantitativa para H 2 O₂mitocondrial em condições normaisde crescimento e exposição ao estresse oxidativo. Este protocolo explica como otimizar as condições de imagem usando um sistema de microscópio confocal de disco giratório e realizar análise quantitativa usando software disponível gratuitamente. Essas ferramentas permitem coletar ricas informações espaço-temporais sobre as mitocôndrias tanto dentro das células quanto entre as células de uma população. Além disso, o fluxo de trabalho descrito aqui pode ser usado para validar outros biossensores.

Introduction

As mitocôndrias são organelas celulares eucarióticas essenciais que são bem conhecidas por sua função na produção de ATP através da fosforilação oxidativa e transporte de elétrons¹. Além disso, as mitocôndrias são locais de armazenamento de cálcio, síntese de lipídios, aminoácidos, ácidos graxos e clusters ferro-enxofre e transdução de sinal ^2,3. Dentro das células, as mitocôndrias formam uma rede dinâmica com morfologia e distribuição características, que varia de acordo com o tipo celular e o estado metabólico. Além disso, embora as mitocôndrias possam se fundir e se dividir, nem todas as mitocôndrias de uma célula são equivalentes. Numerosos estudos têm documentado a heterogeneidade funcional das mitocôndrias dentro de células individuais em atributos como potencial de membrana e estado oxidativo ^4,5,6. Essa variação na função mitocondrial deve-se, em parte, a danos na organela causados por mutações no mtDNA (que ocorrem em uma taxa maior do que no DNA nuclear) e a danos oxidativos por espécies reativas de oxigênio (EROs) geradas dentro e fora da organela ^7,8,9. Os danos à organela são atenuados por mecanismos de controle de qualidade mitocondrial que reparam o dano ou eliminam as mitocôndrias que são danificadas além do reparo¹⁰.

O peróxido de hidrogênio (H2 O₂) é uma espécie reativa de oxigênio que é fonte de dano oxidativo a proteínas celulares, ácidos nucléicos e lipídios. Entretanto, a H2 O₂ também serve como molécula sinalizadora que regula as atividades celulares através da oxidação reversível de tióis em proteínas-alvo^11,12. H 2O₂ é produzido a partir de elétrons que extravasam da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial e por enzimas específicas, como NADPH oxidase e monoamina oxidases 13,14,15,16,17,18,19,20. Também é inativada por sistemas antioxidantes, incluindo aqueles à base de tiorredoxina e glutationa^21,22,23. Assim, a análise dos níveis mitocondriais de H 2O₂é fundamental para a compreensão do papel deste metabólito na função mitocondrial e celular normal e em condições de estresse oxidativo.

O objetivo geral deste protocolo é detectar mitocondrial H 2 O 2 usandoum biossensor H 2 O ₂geneticamente codificado, HyPer7, que é direcionado para a organela (mtHyPer7). mtHyPer7 é uma quimera que consiste na sequência de sinais mitocondriais de ATP9 (a pré-sequência Su9), uma forma circularmente permutada de proteína fluorescente verde (GFP), e o domínio de ligaçãoH 2 O₂ da proteína OxyR de Neisseria meningitidis²⁴ (Figura 1). Na GFP circularmente permutada, os termini N- e C- da GFP nativa são fundidos e novos termini são formados perto do cromóforo, o que confere maior mobilidade à proteína e maior labilidade de suas características espectrais em comparação com a GFP^{nativa 25}. A interação do domínio OxyR do mtHyPer7 com H 2 O 2 é de alta afinidade, H 2 O_2-seletiva, eleva à oxidação reversível dos resíduos conservados de cisteína e formação de pontes dissulfeto. Mudanças conformacionais associadas à oxidação de OxyR são transferidas para a GFP circularmente permutada em mtHyPer7, o que resulta em um deslocamento espectral no máximo de excitação do cromóforo mtHyPer7 de 405 nm no estado reduzido para 488 nm no estado H 2 O_2-oxidado²⁶. Assim, a razão de fluorescência do mtHyPer7 em resposta à excitação a 488 nm versus 405 nm reflete a oxidação da sonda por H 2 O₂.

Idealmente, um biossensor deve fornecer uma leitura quantitativa, absoluta e em tempo real de sua molécula-alvo. Infelizmente, no entanto, isso nem sempre é possível em medições do mundo real. No caso de sensores de oxidação, como o mtHyPer7, a leitura em tempo real é afetada pela taxa de redução da ponte dissulfeto. Os sistemas de redução utilizados pelos biossensores ROS diferem e podem alterar drasticamente a dinâmica da resposta da sonda, como demonstrado pela comparação entre HyPer7, reduzido pelo sistema tiorredoxina, e roGFP2-Tsa2ΔC_R, reduzido por glutationa no citosol de levedura²⁷. Assim, para se concluir sobre a concentração relativa de H2 O₂ a partir das razões mtHyPer7, deve-se assumir que o sistema de redução mantém uma capacidade constante durante o experimento. Apesar dessas considerações, HyPer7 e sondas relacionadas têm sido utilizadas em vários contextos para obter informações sobre H 2 O₂em células vivas ^25,28,29.

Figura 1: Projeto, mecanismo molecular e espectros de excitação/emissão do biossensorH 2 O₂ mtHyPer7. (A) A sonda mtHyPer7 é derivada pela inserção de GFP circularmente permutada no domínio OxyR-RD de Neisseria meningitidis. Contém a sequência de alvo mitocondrial da subunidade 9 da ATP sintase de Neurospora crassa (Su9). (B) Ilustração do mecanismo de detecção de H 2 O₂do mtHyPer7. A oxidação de cisteínas no domínio RD aumenta a emissão de fluorescência após excitação a 488 nm e diminui a emissão produzida por excitação a 405 nm. (C) Espectros de excitação e emissão de HyPer7 nas formas oxidadas e reduzidas. Esta figura é reimpressa com permissão de Pak et ^al.24. Abreviações: GFP = proteína fluorescente verde; cpGFP = GFP permutada circularmente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Esta imagem ratiométrica do mtHyPer7 oferece benefícios importantes para a quantificação mitocondrial deH 2 O₂ ^24,27; Fornece um controle interno para a concentração da sonda. Além disso, o deslocamento no pico de excitação produzido pelaexposição a H 2 O 2 não é completo, mesmo em concentrações de saturação de H 2 O ₂. Assim, a razão de imagem pode aumentar a sensibilidade incorporando dois pontos espectrais na análise.

A sonda mtHyPer7 aqui utilizada tem uma afinidade muito alta por H 2 O₂e sensibilidade relativamente baixa ao pH²⁴, e tem sido direcionada com sucesso para as mitocôndrias de Caenorhabditis elegans ³⁰. Essa proteína também tem sido utilizada em leveduras ^27,31. No entanto, estudos anteriores basearam-se na expressão plasmidial de mtHyPer7, que resulta em variabilidade célula-célula na expressão de sonda²⁷. Além disso, o construto descrito neste protocolo foi integrado em uma região conservada e livre de genes no cromossomo X³² usando uma abordagem baseada em CRISPR para integração livre de marcadores. A expressão do gene biossensor integrado também é controlada pelo forte promotor constitutivo TEF1 (Figura 2). Como resultado, há uma expressão mais estável e consistente do biossensor em populações de células de levedura em comparação com aquela observada usando a expressão de biossensores transmitidos por plasmídeos, e as células portadoras do biossensor podem ser propagadas sem a necessidade de meios seletivos.

Figura 2: Geração de células que expressam mtHyPer7 por CRISPR. A construção do biossensor contendo plasmídeo (YN2_1_LT58_X2site) e plasmídeo contendo Cas9 e sgRNA amplificado por PCR mtHyPer7 é introduzida em células de levedura brotantes por transformação em acetato de lítio. O sítio de inserção livre de genes no cromossomo X (X2) é reconhecido e cortado pela proteína Cas9 com o sgRNA, e o biossensor é integrado ao genoma por recombinação homóloga. Após a identificação dos transformantes bem-sucedidos por triagem microscópica, PCR de colônia e sequenciamento, o plasmídeo Cas9 é removido (curado) por crescimento em meios não seletivos. Abreviações: sgRNA = single guide RNA; TEF = fator intensificador de transcrição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Finalmente, o mtHyPer7 oferece vantagens sobre outros biossensores ROS. Por exemplo, corantes orgânicos usados para detectar ROS (por exemplo, diidroetídio [DHE]² e MitoSOX³) podem produzir coloração irregular ou inespecífica e são frequentemente administrados em solventes como etanol ou dimetilsulfóxido, que requerem controles adicionais para efeitos de solventes. Outra classe de biossensores ROS são os biossensores baseados em transferência de energia por ressonância fluorescente (FRET) (por exemplo, Redoxfluor para estado redox celular⁴ e os sensores de peróxido HSP-FRET⁵, OxyFRET 6 e PerFRET⁶). Essas sondas são codificadas geneticamente e altamente sensíveis em princípio e podem ser quantitativamente direcionadas para mitocôndrias usando sequências de sinal mitocondriais bem caracterizadas. No entanto, existem desafios no uso de sondas baseadas em FRET, incluindo antecedentes devido à excitação cruzada e sangria, e requisitos rigorosos para a proximidade e orientação dos fluoróforos para que ocorra FET^33,34. Além disso, as sondas FRET consistem de duas proteínas fluorescentes que requerem construções maiores para expressão em células de interesse em comparação com sondas que deslocam espectros. O protocolo aqui descrito foi desenvolvido para aproveitar os pontos fortes do biossensor baseado em HyPer7 e usar esta sonda compacta, ratiométrica, de alta afinidade e geneticamente codificada para imagens quantitativas de peróxido em mitocôndrias em leveduras vivas.

Protocol

1. Geração do plasmídeo biossensor, integração no genoma da levedura e avaliação do direcionamento do mtHyPer7 para mitocôndrias e efeitos na morfologia mitocondrial, taxas de crescimento celular ou sensibilidade ao estresse oxidativo NOTA: Consulte o Arquivo Suplementar 1, a Tabela Suplementar S1, a Tabela Suplementar S2 e a Tabela Suplementar S3 para a construção de plasmídeos de biossensores, cepas, plasmídeos e primers, respectivamente, usados para construção e caracterização de biossensores. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo. Amplificar a construção do biossensor a partir do plasmídeo do biossensor usando os primers Y290 e Y291 (Figura 2) via reação em cadeia da polimerase (PCR). Misturar 500 ng do plasmídeo Cas9/RNA guia (YN2_1_LT58_X2site32) com 50 μL do produto da PCR do passo 1.1 (construção do biossensor). Transformar a mistura em levedura brotante usando o método de acetato de lítio35 e selecionar transformadores em placas de YPD contendo 200 mg/mL G418. Triagem de transformadores candidatos por PCR amplificação do DNA genômico usando os primers Y292 e Y293. Para transformadores com inserção do tamanho esperado (positivo: 3,5 kb; negativo: 0,3 kb), sequencie a região inserida para posterior validação. Avaliar o efeito do biossensor sobre o crescimento e a função mitocondrial (Figura 3). Se o biossensor parece afetar a função das células ou mitocôndrias, tente minimizar o efeito alterando o promotor, o local de integração ou a cepa pai.Determinar o efeito da construção do biossensor na taxa de crescimento na presença e ausência de um estressor oxidativo (por exemplo, paraquat), conforme descrito anteriormente36.Diluir as células da fase média logarítmica para uma densidade óptica de 600 nm (OD600) de 0,0035 em 200 μL do meio correspondente com e sem tratamento em cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços. Meça a densidade óptica da cultura a cada 20 min por 72 h usando um leitor de placas. Calcule a taxa máxima de crescimento (inclinação) como a mudança máxima na DO durante um intervalo de 240 minutos durante o curso de 72 horas. Visualize as células por microscopia de fluorescência e avalie o brilho e a morfologia mitocondrial conforme descrito anteriormente37.Cresça as células até a fase logarítmica, core as mitocôndrias com 250 nM MitoTracker Red por 30 min e lave duas vezes antes de obter imagens. Capture pilhas Z de 6 μm de profundidade a intervalos de 0,3 μm em um microscópio de fluorescência confocal ou de campo largo e inspecione visualmente. Procure mitocôndrias formando estruturas tubulares alongadas. Figura 3: O mtHyPer7 é direcionado para as mitocôndrias e não afeta a morfologia mitocondrial, o crescimento celular ou a sensibilidade ao estresse oxidativo. (A) Morfologia mitocondrial em células de leveduras vivas expressando mtHyPer7. Painel esquerdo: mtHyPer7 visualizado com excitação de 488 nm. Painel do meio: mitocôndrias marcadas com 250 nM MitoTracker Red. Painel direito: imagens mescladas. Projeções de intensidade máxima são mostradas. O contorno da célula é mostrado em branco. Barra de escala = 1 μm. (B,C) Curvas de crescimento e taxa máxima de crescimento de células selvagens e células expressando mtHyPer7 cultivadas na presença (+PQ) ou ausência de 2,5 mM de paraquat em meios YPD. (D,E) Curvas de crescimento e taxa máxima de crescimento de células selvagens e que expressam mtHyPer7 cultivadas na presença (+PQ) ou ausência de paraquat 2,5 mM em meios SC. Todas as curvas de crescimento são a média de três réplicas independentes. As taxas máximas de crescimento são representadas como média ± erro padrão da média (EPM). A análise da curva de crescimento foi feita diluindo-se as células da fase média logarítmica para um OD600 de 0,0035 em 200 μL do meio correspondente em cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços. A DO da cultura foi medida a cada 20 min durante 72 h usando um leitor de placas. Cada linhagem/condição foi semeada em triplicata e a taxa média de crescimento foi plotada. A taxa máxima de crescimento (inclinação) foi calculada usando as mudanças na DO ao longo de um intervalo de 240 min ao longo de 72 h. Abreviações: WT = wild type; PQ = paraquat. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 2. Cultura celular e preparo para aquisição de imagens (Figura 4) Propagar as células em meio sintético até a fase logarítmica para aquisição de imagens. Uma cultura de 5 mL de fase intermediária fornece células suficientes para quatro ou cinco lâminas e um total de >100 células brotadas para análise.Pela manhã, no dia anterior ao experimento, preparar pré-culturas líquidas inoculando 5 mL de meio sintético completo (SC) em um tubo de fundo cônico de 50 mL com uma única colônia de células de levedura. Incubar a pré-cultura em agitador orbital a 200 rpm e 30 °C por 6-8 h. Medir o OD600 da pré-cultura, que deve estar na fase de log médio: ~0,5-1 × 107 células/mL, OD600 ~0,1-0,3. Prepare uma cultura de fase intermediária usando a pré-cultura para geração de imagens no dia seguinte. Calcular a quantidade de pré-cultura necessária para uma cultura de fase intermediária após o crescimento noturno (8-16 h). Quando as células são cultivadas em meio SC, o tempo de duplicação é de ~2 h. Portanto, o volume (V) de pré-cultura para inoculação de uma cultura noturna de 5 mL é calculado usando a equação (1):(1º) Inocular 5 mL de meio SC em um tubo de fundo cônico de 50 mL com a quantidade de pré-cultura calculada na etapa 2.1.3. Crescer em um agitador orbital a 200 rpm e 30 °C por 8-16 h. No dia da aquisição de imagens, confirme se a cultura gerada na etapa 2.1.4 está na fase logarítmica média (OD600 ~0,1-0,3). Concentrar as células de 1 mL da fase média de cultura logarítmica por centrifugação a 6.000 × g por 30 s. Retire o sobrenadante, deixando 10-20 μL do sobrenadante no tubo. Ressuspenda o pellet de células misturando suavemente com o meio residual usando uma micropipeta. Use um soprador de ar ou tecido sem fiapos para remover a poeira de uma lâmina de microscópio de vidro e adicione 1,8 μL da suspensão celular à lâmina. Cubra as células com uma lamínula de vidro #1,5 (170 μm de espessura), abaixando a lamínula lentamente em um ângulo para evitar a introdução de bolhas. Imagem imediata e descarte o slide após 10 min de imagem. Figura 4: Crescimento celular e exames de imagem. Células de levedura brotantes expressando mtHyPer7 são cultivadas até a fase logarítmica. As imagens da série Z são coletadas por microscopia confocal de disco giratório e, em seguida, submetidas à reconstrução e análise 3D. Ver seções de protocolo 2-3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 3. Otimização das condições de imagem e coleta de imagens (Figura 5) Selecione um modo de geração de imagens. Para seccionamento óptico sem pós-processamento, um instrumento confocal de disco giratório é preferível. No entanto, se o sinal estiver baixo, ou se esse instrumento não estiver disponível, use imagens de campo amplo, garantindo que as imagens de campo largo sejam desconvolvidas para remover o desfoque fora de foco, como descrito anteriormente38. Selecione óptica. Use uma lente de imersão em óleo de alta abertura numérica, como 100x/1.45 Plan-Apochromat. Selecione comprimentos de onda de excitação e emissão. Para imagens confocais de disco giratório, use uma excitação a laser a 405 nm e 488 nm e um filtro de emissão GFP padrão. Para imagens de campo amplo, use um diodo emissor de luz (LED) ou excitação da lâmpada, mas certifique-se de que a configuração do filtro permita a variação da excitação ao passar a emissão pelo filtro GFP padrão.NOTA: Isso pode ser feito, por exemplo, removendo o filtro de excitação de um cubo GFP e usando um LED ou roda de filtro para selecionar a excitação. Selecione o tempo de exposição e a intensidade de iluminação.Estabeleça condições de aquisição que produzam um sinal prontamente detectável e resolução aceitável em cada canal de fluorescência. Por exemplo, em um microscópio confocal de disco giratório com uma câmera sCMOS, use 2 x 2 binning, 20-40% de potência do laser e 200-600 ms de exposição. Examine o histograma da imagem. Em uma imagem de 12 bits (4.096 níveis de cinza possíveis), certifique-se de que o intervalo dinâmico total dos valores de pixel seja de pelo menos várias centenas de níveis de cinza, sem saturação (Figura 5A). Além disso, certifique-se de que o alcance seja uma ordem de magnitude maior do que o nível de ruído. Calcular o nível de ruído como o desvio padrão dos valores de pixel em uma área livre de células de uma imagem, medido conforme descrito na etapa 4.1.3.1. Teste para fotoclareamento ou estresse mitocondrial induzido por imagem nas condições de imagem selecionadas. Se for observado fotoclareamento excessivo ou aumento da mitocôndria H 2O2, reduza a potência do laser e aumente a exposição ou binning.Coletar uma série de imagens em time-lapse, sem atraso entre as aquisições, para avaliar os efeitos das condições de imagem na estabilidade do sinal e no estresse oxidativo nas mitocôndrias. Usando o software de aquisição do microscópio ou ImageJ, meça o valor médio do pixel em cada canal de fluorescência para confirmar a estabilidade do sinal (<5% de mudança; Figura 5B). Se o experimento não envolver imagens de lapso de tempo, certifique-se de que a fluorescência seja estável em duas ou três pilhas Z repetidas (25-35 exposições).NOTA: Uma diminuição na fluorescência de ambos os canais pode indicar fotoclareamento; no entanto, uma diminuição na fluorescência excitada por 405 nm, acompanhada por um aumento no canal excitado por 488 nm, pode indicar aumento do H 2 O2mitocondrial e estresse oxidativo induzido por imagem na organela. Adquirir imagens. Se estiver coletando pilhas Z, verifique se o intervalo Z é o mesmo para todas as imagens no conjunto de dados e inclua a célula inteira. Para leveduras em brotamento, imagem com intervalo Z de 0,5 μm e profundidade total de 6 μm. Adquira imagens de luz transmitida para documentar limites de células. Analise as imagens manual ou semiautomaticamente através dos scripts disponíveis no Arquivo Suplementar 2 e no https://github.com/theresaswayne/biosensor, utilizando a distribuição Fiji do ImageJ39 e o software estatístico R (Figura 6). Nas instruções do software, os comandos de menu hierárquico são mostrados em negrito com “|”, indicando uma sequência de seleções de menu. Opções e botões são mostrados em negrito. Figura 5: Otimização de imagem . (A) Avaliação de imagens e histogramas para a faixa de intensidade correta. Projeções de intensidade máxima de imagens confocais de disco giratório são mostradas. Os histogramas são mostrados com um eixo Y linear (preto) e um eixo Y em escala logarítmica (cinza) para ilustrar o intervalo dinâmico da imagem. Painéis esquerdos: imagem ruidosa com baixa intensidade e alcance dinâmico. Painéis centrais: uma imagem com um intervalo dinâmico aceitável (~1.000 níveis de cinza) e intensidade. Painéis à direita: uma imagem com contraste indevido para produzir saturação excessiva. Barra de escala = 1 μm. (B,C) Análise do fotoclareamento do mtHyPer7. Pilhas Z sucessivas foram coletadas sem atraso, pilhas Z foram somadas e a intensidade média das mitocôndrias foi medida e normalizada até o primeiro ponto de tempo. Os resultados dos três primeiros momentos (27 exposições) são mostrados. (B) Comprimento de onda de excitação: 405 nm. (C) Comprimento de onda de excitação: 488 nm. Os valores apresentados são as médias de três células de cada um dos três ensaios independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 4. Análise semiautomatizada com scripts Gere e meça imagens de razão usando um script de análise de biossensor (por exemplo, biosensor.ijm ou biosensor-image-subtraction.ijm).Selecione o script a ser usado. O protocolo para usar cada script é semelhante; quaisquer diferenças serão especificadas no texto.biosensor.ijm: Neste script, o plano de fundo e o ruído são corrigidos usando áreas de imagem selecionadas pelo usuário, valores fixos ou nenhuma subtração. Selecione métodos para correção de fundo e ruído de forma independente. biosensor-image-subtraction.ijm: Neste script, o plano de fundo e o ruído são manipulados pelo mesmo método selecionado pelo usuário, que pode ser um dos seguintes: imagem em branco, área selecionada pelo usuário dentro da imagem, valor fixo ou nenhuma correção. Em Fiji, abra uma imagem de pilha Z multicanal adquirida na etapa 3.5. Abra o arquivo de script de análise de biossensor desejado. Execute o script clicando em Executar na janela Editor de Scripts . Na janela de diálogo exibida, insira as informações solicitadas.Selecione os números de canal do numerador e denominador para o cálculo da razão. Para mtHyPer7, o numerador é o canal excitado a 488 nm, e o denominador é o canal excitado a 405 nm. Selecione o número do canal da imagem de luz transmitida, se presente, ou 0 , se não houver nenhum. Selecione o método de subtração em segundo plano desejado nas quatro opções a seguir. Se o plano de fundo for relativamente uniforme, escolha Selecionar uma área de imagem, que mede diretamente o nível de plano de fundo na imagem. Se o plano de fundo variar substancialmente em todo o campo, use o script biosensor-image-subtraction.ijm e selecione Imagem em branco (para coletar uma imagem em branco para correção, capture uma pilha Z multicanal com condições de aquisição idênticas em um campo de visão livre de células ou a partir de um slide feito com meio de crescimento livre de células). O valor fixo permite a entrada de um valor de fundo medido anteriormente. Nenhum deixa o fundo sem correção, mas pode reduzir a precisão da medição. Selecione o método de subtração de ruído desejado. O valor de ruído é usado como um limiar mais baixo nas imagens de canal mascarado subtraídas em segundo plano para reduzir o efeito da variação aleatória na leitura do detector. Opte por Selecionar uma área de imagem ou Valor fixo para permitir a entrada de um nível de ruído previamente medido, que geralmente funciona bem, pois os níveis de ruído são constantes se as condições de imagem forem mantidas constantes. Como alternativa, escolha Nenhum e use um valor de 1 como o limite inferior, o que pode aumentar a variabilidade das medidas. Selecione um algoritmo de limiar para detectar mitocôndrias de forma precisa e consistente; Otsu ou MaxEntropy são recomendados. O ideal é usar o mesmo algoritmo para todas as imagens de um experimento, mas garantir o reconhecimento preciso das mitocôndrias. Use um método de limiar diferente se houver mudanças na morfologia durante um experimento. Selecione o número de regiões de interesse (ROIs) por célula. Por exemplo, se medir as diferenças mãe-gema, selecione 2. Selecione a pasta de saída onde as imagens de medidas e proporções serão salvas. Siga as instruções para correção de fundo e ruído.Seleção de área (se aplicável): Se Selecionar uma área de imagem foi escolhida para medição de plano de fundo ou ruído, siga as instruções para desenhar uma área de plano de fundo (fora de quaisquer células ou artefatos fluorescentes) usando a ferramenta ROI de retângulo. Depois de desenhar a área, clique em OK. Entrada de valor fixo (se aplicável): Se o valor fixo foi escolhido para medição de fundo ou ruído, siga as instruções para inserir valores de fundo e/ou ruído para cada canal de fluorescência. Imagem de referência em branco (se aplicável): No script biosensor-image-subtraction.ijm, se a imagem em branco foi escolhida para correção de fundo ou ruído, siga as instruções para selecionar um arquivo de imagem em branco. Marque ROIs para medição. Em culturas de fase intermediária, restrinja a análise a células brotadas.Desenhe ROIs correspondentes a células individuais ou regiões subcelulares com base na imagem de campo brilhante. A ROI não precisa corresponder exatamente ao contorno celular, pois apenas as mitocôndrias limiares dentro da ROI serão medidas. Como alternativa, abra um conjunto de ROI salvo anteriormente: no Gerenciador de ROI, clique em Mais e selecione o arquivo de ROI. Pressione T depois de criar cada ROI para adicionar o ROI selecionado ao ROI Manager. No Gerenciador de ROI, marque Mostrar tudo para documentar as células marcadas. Cada região adicionada aparecerá como um item numerado na lista Gerenciador de ROI. Se analisar mais de uma ROI por célula (por exemplo, mãe e broto), marque as ROIs na mesma ordem para cada célula analisada. Depois que todos os ROIs desejados tiverem sido adicionados ao Gerenciador de ROI, clique em OK na janela de diálogo Marcar células . Escolha o formato da tabela de medição. Na janela de diálogo MultiMeasure exibida, marque Medir todas as fatias. Marque a opção Uma linha por fatia para produzir uma tabela com o formato desejado. Use o process_multiROI_tables. Script R para processar tabelas criadas com a opção Uma linha por fatia ; não marque Anexar resultados. Repita esta etapa 3x (para medição das imagens do numerador [488], denominador [405] e razão [488/405]). O script salvará os arquivos de saída na pasta selecionada na etapa 4.1.2.6. Cálculo das razões médias ponderadas para cada região ou célulaUsando os resultados obtidos na etapa anterior, calcule as razões das médias ponderadas para cada região ou célula usando a equação (2). Calcule as proporções “pixelwise” ou “regionwise” (consulte a discussão para obter detalhes).(2º)Observação : os valores de área e densidade integrada (IntDen) incluem apenas os pixels dentro da mitocôndria limiarizada. Esse cálculo pode ser automatizado usando o process_multiROI_tables. Script R e software estatístico R. Gere uma imagem de proporção colorida. Como as mudanças na tonalidade (cor) são mais óbvias para o olho humano do que as mudanças na intensidade, converta o valor da razão em uma escala de cores para facilitar a interpretação visual. O script colorize_ratio_image.ijm colorirá uma imagem de proporção mascarada.Em Fiji, abra uma imagem de pilha Z de proporção gerada na etapa 4.1.6. Abra o arquivo de script colorize_ratio_image.ijm. Execute o script clicando em Executar na janela Editor de Scripts . Na janela de diálogo exibida, insira as informações solicitadas.Método de colorização: Na opção Não modulado , todos os pixels mitocondriais aparecem no mesmo brilho. No entanto, algumas imagens podem parecer barulhentas, pois pixels fracos e brilhantes contribuem para a imagem de proporção. Para reduzir esse efeito, use a opção Intensidade modulada . Valor mínimo e máximo exibido: esses valores controlam o intervalo de valores de razão que serão coloridos. Escolha valores próximos aos valores mínimos e máximos médios observados em um experimento (com base nas razões médias ponderadas calculadas na etapa 4.2.1). Dentro de um experimento, certifique-se de adquirir todas as imagens com condições de imagem idênticas e exibir todas as imagens com valores mínimos e máximos idênticos. Modo de projeção: pilhas Z são exibidas como projeções para mostrar toda a população mitocondrial. A projeção é criada antes da colorização. Selecione Máximo para uma projeção de intensidade máxima (preservando os valores de razão e intensidade máxima) ou Média para uma projeção de intensidade média. Pasta de saída: selecione a pasta na qual salvar as imagens coloridas. Se a opção Não modulado foi selecionada, selecione um esquema de cores (tabela de pesquisa; LUT) na janela de diálogo exibida. Use as LUTs RGB Fire ou Rainbow embutidas em Fiji, ou qualquer LUT desejada no formato .lut do ImageJ (Importar do arquivo LUT). O Rainbow Smooth40 LUT é recomendado (incluído no Arquivo Suplementar 2 e no GitHub). O script salva os arquivos de saída na pasta selecionada na etapa 4.3.1.4. Estes incluem a imagem de razão colorizada (Color_RGB.tif) e a imagem de razão colorizada com uma barra de calibração mostrando a correspondência entre os valores de razão e a cor da imagem (Color_with_bar.tif). 5. Análise manual Observação : essa abordagem leva mais tempo, mas permite flexibilidade no pré-processamento e na definição do limite. Correto para o plano de fundo.Definir opções em Fiji.Clique em Analisar | Definir medidas. Na janela de diálogo exibida, marque as caixas de Área, Média, StdDev, IntDen e Rótulo de Exibição. Defina as casas decimais como 3. Clique em Editar | Opções | Entrada/Saída. Na janela de diálogo exibida, marque as caixas Salvar números de linha e Salvar cabeçalhos de coluna. Para aumentar a sensibilidade do cálculo da razão, subtraia o fundo de cada canal de fluorescência. Se o plano de fundo for relativamente uniforme, meça a intensidade média de uma área livre de células em uma imagem e subtraia esse valor de toda a imagem (etapa 5.1.2.1). Alternativamente, se o plano de fundo variar substancialmente entre o campo, use uma imagem em branco para correção (etapa 5.1.2.2.).Para subtrair uma região selecionada pelo usuário, clique em Imagem | Cor | Divida os canais e mantenha todas as imagens do canal abertas, pois elas serão necessárias posteriormente. Para cada canal de fluorescência, desenhe um ROI no plano de fundo (fora de qualquer célula) e clique em Analisar | Medir ou, para pilhas, clicar em Imagem | Pilhas | Pilha de medidas. Observe o valor médio da ROI que aparece na tabela Resultados . Clique em Editar | Selecione Nenhum e, em seguida, Processar | Matemática | Subtrair. Na janela de diálogo exibida, insira o valor médio de plano de fundo medido, arredondado para o número inteiro mais próximo.Observação : arredondamento evita erros com operações binárias mais tarde. Para subtrair uma imagem em branco de um arquivo de dados, colete uma imagem em branco de um campo de visão completamente livre de células ou de um slide preparado com meio de crescimento sem células. Clique em Processo | Calculadora de Imagem. Na janela de diálogo exibida, defina a operação como Subtrair e defina Image1 e Image2 como a imagem de célula e a imagem em branco, respectivamente. Marque Criar nova janela e Resultado de 32 bits. Para limitar a análise às mitocôndrias, realizar segmentação. Como cada canal pode mudar de intensidade dependendo do estado do biossensor, use a soma dos dois canais para definir a área das mitocôndrias de forma consistente.Para criar uma imagem de soma, clique em Processo | Calculadora de Imagem. Na janela de diálogo exibida, defina a operação como Adicionar e defina Image1 e Image2 para os dois canais fluorescentes subtraídos em segundo plano em qualquer ordem. Marque Criar nova janela e Resultado de 32 bits e aguarde até que uma imagem de soma apareça. Defina o limite para definir mitocôndrias na imagem de soma.Clique na Imagem | Ajustar | Limite. Na janela Limiar exibida, marque Fundo escuro e Histograma de pilha. Defina Método para o algoritmo desejado (por exemplo, Otsu ou MaxEntropy). Utilize limiares automatizados para reprodutibilidade, mas se nenhum método automático for adequado, ajuste manualmente o limite.NOTA: Idealmente, o mesmo algoritmo deve ser usado para todas as imagens em um experimento, mas mudanças na morfologia durante um experimento podem exigir um método de limiar diferente em algumas condições. Quando o limite for satisfatório, clique em Aplicar. Na janela de diálogo exibida, escolha Converter em máscara. Na janela de diálogo exibida, marque Fundo preto e deixe as outras caixas desmarcadas. Salve a imagem da máscara resultante para avaliar a precisão da segmentação. Converta os valores da máscara de 0 e 255 para 0 e 1, respectivamente, clicando em Processo | Matemática | Divida. Defina o valor como 255 e, quando solicitado, selecione a opção para processar todas as imagens. Aplique a máscara aos canais de fluorescência subtraídos em segundo plano clicando em Processo | Calculadora de Imagem. Na janela de diálogo exibida, defina a operação como Multiplicar. Defina Image1 e Image2 para o canal do numerador e a máscara, respectivamente. Marque Criar nova janela e Resultado de 32 bits; Repita a multiplicação da máscara com o canal denominador. Prepare cada canal mascarado para o cálculo da proporção definindo os pixels de plano de fundo como NaN (“não um número”).Selecione o canal do numerador mascarado e clique em Imagem | Ajustar | Limite. Na janela Limite , clique em Definir e, na janela de diálogo exibida, defina o mínimo para o nível de ruído calculado ou para 1 e deixe o máximo como está. Na janela Limite , clique em Aplicar. Na próxima caixa de diálogo, escolha Definir como NaN. Repita para o canal do denominador mascarado. Gere a imagem de proporção.Clique em Processo | Calculadora de Imagem. Na janela de diálogo exibida, defina operação como Dividir. Defina Image1 e Image2 para os canais de numerador e denominador mascarados subtraídos em segundo plano, respectivamente. Para mtHyPer7, o numerador é a forma oxidada excitado a 488 nm, e o denominador é a forma reduzida excitado a 405 nm. Portanto, razões mais altas indicam maior H 2O2. Marque Criar nova janela e Resultado de 32 bits. Salve a imagem de proporção para análise. Marcar e quantificar áreas de interesse. Cada célula ou região subcelular é selecionada e armazenada como um ROI no ROI Manager. As ROIs não precisam corresponder perfeitamente aos contornos celulares, pois apenas as regiões mascaradas das mitocôndrias serão medidas.Usando a imagem de luz transmitida para evitar viés, crie ROIs correspondentes a células individuais (ou regiões subcelulares). Em culturas de fase intermediária, restrinja a análise a células de levedura portadoras de brotos, que estão ativamente envolvidas na divisão celular. Pressione T depois de criar cada ROI para adicioná-lo ao ROI Manager. Marque Mostrar tudo para documentar as células que foram marcadas. Clique na imagem de proporção criada acima, e no ROI Manager, clique em Mais … | Multimedida. Na janela de diálogo exibida, marque Medir todas as fatias. Não marque Anexar resultados. Marque a opção Uma linha por fatia para produzir uma tabela com o formato desejado. O process_multiROI_tables. O script R processará tabelas criadas com a opção Uma linha por fatia no software estatístico R. Salve os resultados. Clique na janela Resultados e, em seguida, em Arquivo | Salve e salve a tabela de resultados em .csv ou .xls formato. Defina o nome do arquivo para corresponder ao nome da imagem. Salve os ROIs. No Gerenciador de ROI, primeiro certifique-se de que nenhum ROI esteja selecionado: clique em Desmarcar e, em seguida, em Mais | Salve. Abra as ROIs salvas junto com a imagem original em Fiji para cruzar as medidas com a imagem. Calcule as razões médias ponderadas por célula ou região usando os resultados obtidos na etapa anterior e na equação (3). Calcule as proporções “pixelwise” ou “regionwise” (consulte a discussão para obter detalhes).(3º)NOTA: Os valores de área e densidade integrada incluem apenas os pixels dentro das mitocôndrias limiares. Esse cálculo pode ser automatizado usando o process_multiROI_tables. Script R no software estatístico R. Gere uma imagem de proporção colorida.NOTA: As imagens coloridas podem ser não moduladas, onde todos os pixels mitocondriais aparecem no mesmo brilho, ou moduladas por intensidade, onde a intensidade de pixels na imagem original é usada para definir intensidades na imagem colorida.Para produzir uma imagem colorida não modulada:Abra a imagem de proporção gerada acima. Clique na Imagem | Duplique para gerar uma cópia da imagem e, em seguida, feche a imagem original. Se a imagem for uma pilha Z, selecione uma única fatia ou gere uma projeção Z para visualizar todas as mitocôndrias. Use uma projeção de intensidade máxima (mantendo a razão máxima e os valores de intensidade em cada coordenada de pixel XY) ou uma projeção de intensidade média. Clique na Imagem | Pesquise tabelas e defina o LUT para o esquema de cores desejado (por exemplo, Rainbow RGB ou Fire [disponível por padrão no ImageJ]). Alternativamente, clique em Arquivo | Importe LUT e selecione qualquer LUT desejada no formato .lut do ImageJ, como Rainbow Smooth40 (incluído no Arquivo Suplementar 2 e no GitHub). Verifique se a LUT tem uma cor escura atribuída ao valor 0. Defina o contraste da tela clicando em Imagem | Ajustar | Brilho/Contraste. Na janela Brilho/Contraste, clique em Definir e, na janela de diálogo exibida, insira os valores desejados para os valores Mínimo e Máximo exibidos. Para maximizar as diferenças de cor observadas, defina-as como aproximadamente o mínimo e o máximo obtidos em todas as imagens. Defina todas as imagens em um experimento para os mesmos níveis de contraste.Observação : não clique em Aplicar porque isso irá alterar os valores de pixel e impedir a geração de uma barra de calibração precisa na próxima etapa. Adicione uma barra de calibração de cores clicando em Analisar | Ferramentas | Barra de calibração. Na janela de diálogo exibida, marque a opção Sobreposição para remover a barra, se desejar, clicando em Imagem | Sobreposição | Remover sobreposição. Se desejar, adicione uma barra de escala clicando em Analisar | Ferramentas | Barra de escala. Na janela de diálogo exibida, defina o tamanho, o local e a cor desejados para a barra. Marque a opção Sobreposição para manter a cor da barra, independentemente da LUT usada. Gere uma imagem RGB para publicação clicando em Imagem | Sobreposição | Achatar. Salve a imagem resultante.NOTA: Esta imagem é apenas para apresentação ou publicação. Os valores de intensidade estão alterados, por isso não podem ser medidos. As barras também são queimadas permanentemente na imagem. Para criar uma imagem de intensidade modulada:Clique na Imagem | Duplique para gerar uma cópia da imagem e feche o original. Se a imagem for uma pilha Z, selecione uma única fatia ou gere uma projeção Z para visualizar todas as mitocôndrias. Defina o contraste de exibição da imagem de proporção clicando em Imagem | Ajustar | Brilho/Contraste e, na janela Brilho/Contraste, clique em Definir. Na janela de diálogo exibida, insira os valores desejados para os valores Mínimo e Máximo exibidos. Para maximizar as diferenças de cor observadas, defina-as como aproximadamente o mínimo e o máximo obtidos em todas as imagens e defina todas as imagens em um experimento com os mesmos níveis de contraste. Clique em Aplicar para redimensionar os valores de pixel. Para criar uma barra de calibração, duplique essa imagem aprimorada e gere uma barra navegando até Analisar | Ferramentas | Barra de calibração. Converta a imagem e sobreponha para o formato RGB clicando em Imagem | Sobreposição | Achatar. Se desejar, cole esta barra na imagem RGB de intensidade modulada obtida na etapa 5.6.2.12 para apresentação ou publicação. Crie uma nova imagem com a mesma largura e altura da imagem clicando em Arquivo | Novo | Imagem…. Na janela de diálogo que se abre, defina os parâmetros da seguinte maneira: Tipo: RGB; Preencha com: Preto; Largura e Altura: 9width e altura da imagem); Fatias: 1. Converta a nova pilha em uma pilha de imagens HSB (matiz, saturação, brilho) clicando em Imagem | Tipo | Pilha HSB. Clique na imagem de proporção ajustada ao contraste navegando até Editar | Selecione Tudo e Editar | Cópia. Em seguida, clique na pilha HSB, selecione a primeira fatia (Hue) e clique em Editar | Colar para transferir os valores de razão. Selecione a fatia 2 (Saturação) da pilha HSB. Defina a cor do primeiro plano como branco navegando até Editar | Opções | Cores. Clique em Editar | Selecione Tudo e Editar | Preencha e, na janela de diálogo que se abre, selecione Não para preencher apenas a fatia atual com branco. Abra a imagem de dados brutos e divida os canais clicando em Imagem | Cor | Canais divididos. Gere a média dos dois canais de proporção usando a Calculadora de Imagem e clicando em Processo | Calculadora de Imagem. Na janela de diálogo exibida, defina a operação como Média e defina Image1 e Image2 para as imagens numerador e denominador, respectivamente. Marque Criar nova janela. Clique na imagem média criada acima, navegando para Editar | Selecione Tudo e Editar | Cópia. Em seguida, clique na pilha HSB, selecione a terceira fatia (Valor) e clique em Editar | Cole para transferir os valores de intensidade. Converta a pilha HSB no espaço de cores RGB clicando em Imagem | Tipo | Cor RGB. Salve a imagem resultante. Figura 6: Esquema de análise e apresentação das imagens. As imagens confocais de disco giratório são primeiro subtraídas em segundo plano. As mitocôndrias são segmentadas por limiares e convertidas em máscaras para cada fatia. Essas máscaras são aplicadas em ambos os canais e as imagens mascaradas são usadas para calcular a imagem de proporção. ROIs são desenhados para medir a razão mtHyPer7 em células ou regiões subcelulares. Imagens de proporção colorida também podem ser geradas para apresentação de dados. Barra de escala = 1 μm. Abreviação: ROI = região de interesse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Representative Results

Para confirmar que mtHyPer7 é uma sonda adequada para avaliar a mitocôndria H 2 O2, a localização de mtHyPer7 e seu efeito sobre as mitocôndrias de levedura e a saúde celular foram avaliados. Para avaliar o alvo do mtHyPer7, as mitocôndrias foram coradas com o corante mitocondrial específico MitoTracker Red em células de levedura controle e leveduras que expressam mtHyPer7. Utilizando a coloração MitoTracker Red, as mitocôndrias foram resolvidas como longas estruturas tubulares que se alinhavam ao longo do eixo mãe-gema e se acumulavam na ponta da gema e na ponta da célula-mãe distal ao broto41. A morfologia mitocondrial foi semelhante nas células controle e mtHyPer7-expressando. Além disso, mtHyPer7 co-localizado com mitocôndrias coradas com vermelho MitoTracker (Figura 3A). Assim, mtHyPer7 foi eficiente e quantitativamente direcionado para mitocôndrias sem afetar a morfologia ou distribuição mitocondrial normal. Em seguida, experimentos adicionais de validação foram realizados para avaliar o efeito do mtHyPer7 na aptidão celular e sensibilidade ao estresse oxidativo em mitocôndrias. As taxas de crescimento das células que expressam mtHyPer7 em meios ricos ou sintéticos à base de glicose (YPD ou SC, respectivamente) são semelhantes às de células selvagens não transformadas (Figura 3B,D). Para avaliar os possíveis efeitos sobre o estresse oxidativo nas mitocôndrias, leveduras controle e expressando mtHyPer7 foram tratadas com baixos níveis de paraquat, uma pequena molécula redox-ativa que se acumula nas mitocôndrias e resulta em níveis elevados de superóxido na organela24,27. Se a expressão de mtHyPer7 induz estresse oxidativo nas mitocôndrias ou protege as mitocôndrias do estresse oxidativo, então as células que expressam mtHyPer7 devem exibir uma sensibilidade aumentada ou diminuída ao tratamento com paraquat, respectivamente. O tratamento com baixos níveis de paraquat resultou em uma diminuição nas taxas de crescimento de leveduras. Além disso, as taxas de crescimento de células selvagens e que expressam mtHyPer7 na presença de paraquat foram semelhantes (Figura 3C,E). Portanto, a expressão do biossensor não criou estresses celulares significativos em células de leveduras em brotamento ou alterou a sensibilidade da levedura ao estresse oxidativo mitocondrial. Dadas as evidências de que o mtHyPer7 é adequado para estudar a mitocôndria H 2 O 2 em levedura em brotamento, testou-se se o mtHyPer7 poderia detectar mitocondrial H 2 O 2 em levedura selvagem de fase média e mudanças na mitocondrial H 2 O 2 induzidas por H 2O2 adicionadas externamente. Um experimento de titulação de H 2 O2foi realizado e a relação média oxidada:reduzida (O/R) mtHyPer7 foi medida nas mitocôndrias. Os scripts de análise automatizados produziram vários arquivos de saída. A imagem de razão (ratio.tif): Uma pilha Z que consiste na proporção das pilhas de 488 nm e 405 nm corrigidas para o plano de fundo. Esta pilha pode ser visualizada em Fiji sem processamento adicional; no entanto, recomenda-se melhorar o contraste e/ou colorir a imagem conforme descrito nas etapas 4.3 ou 5.6 do protocolo antes da visualização. A imagem da máscara (máscara.tif): Uma pilha Z que consiste nas áreas mitocondriais limiares usadas para análise. Essa imagem deve ser usada para avaliar a precisão do limiar. As ROIs usadas para análise (ROIs.zip): Quando esse arquivo é aberto em Fiji, juntamente com a imagem de origem, as ROIs são sobrepostas à imagem para fazer referência cruzada à tabela de resultados e à imagem de origem. Cada ROI é renomeado com um número de célula e um número de ROI. Tabelas de medidas (NumResults.csv, DenomResults.csv, Results.csv) contendo a área, média e densidade integrada de mitocôndrias limiares para cada corte nas imagens numerador, denominador e razão, respectivamente. Nos cortes em que as mitocôndrias estavam ausentes ou fora de foco, o NaN é registrado. Um arquivo de log (Log.txt) documentando as opções usadas para correção de fundo e ruído, limiar e cálculo de proporção. A relação O/R do mtHyPer7 mostrou uma resposta dose-dependente à concentração de H 2 O 2, que atingiu um platô em 1-2 mM adicionado externamente de H 2 O 2(Figura 7). Surpreendentemente, a razão HyPer7 foi menor nas células expostas a 0,1 mM H 2 O2do que nas células controle, embora essa diferença não tenha sido estatisticamente significativa. Uma explicação para esse fenômeno pode ser uma resposta hormese, na qual a exposição a um baixo nível de estressor pode induzir respostas ao estresse, como mecanismos antioxidantes, que por sua vez diminuem a quantidade de ERO detectável pela sonda. Níveis mais altos de estressores, em contraste, podem sobrecarregar as respostas internas ao estresse e resultar em uma leitura mais alta do HyPer7. Figura 7: Resposta do mtHyPer7 ao adicionado externamente H 2 O 2. (A) Projeção máxima de imagens excitadas de 405 nm e 488 nm e projeção de intensidade média de imagens ratiométricas de mtHyPer7 em células de fase média logarítmicas expostas a diferentes concentrações de H 2 O 2. Pseudocolor indica a razão mtHyPer7 oxidada:reduzida (escala na parte inferior). Barra de escala = 1 μm. O contorno da célula é mostrado em branco; n > 100 células por condição. (B) Quantificação da razão mtHyPer7 oxidada:reduzida em células de leveduras brotantes tratadas com diferentes concentrações de H 2 O2. São apresentadas as médias de cinco ensaios independentes, com símbolos de formas e cores diferentes para cada ensaio. Média ± EPM da relação mtHyPer7 oxidado:reduzido: 1,794 ± 0,07627 (sem tratamento), 1,357 ± 0,03295 (0,1 mM), 2,571 ± 0,3186 (0,5 mM), 6,693 ± 0,5194 (1 mM), 7,017 ± 0,1197 (2 mM). p < 0,0001 (ANOVA one-way com teste de comparações múltiplas de Tukey). Os valores de p são indicados como: ****p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Finalmente, estudos prévios revelaram que mitocôndrias mais aptas, que são mais reduzidas e contêm menos superóxido, são preferencialmente herdadas por células-filhas de leveduras4, e que as catalases citosólicas são transportadas e ativadas em células-filhas de leveduras42,43,44,45. Esses estudos documentam a herança assimétrica das mitocôndrias durante a divisão celular de levedura e um papel para esse processo na aptidão e expectativa de vida das células filhas, bem como na assimetria de idade mãe-filha. Para testar se existem diferenças em H 2O2 entre mães e gemas, mtHyPer7 foi medido em gemas e células-mãe. Diferenças na leitura mitocondrial de H 2 O 2 foram observadas dentro das células de levedura, e uma diminuição sutil, mas estatisticamente significativa, na leitura do biossensor H 2 O 2foi detectada nas mitocôndrias do broto em comparação com aquelas na célula-mãe (Figura 8). Esses achados são consistentes com achados anteriores de que as mitocôndrias na gema estão mais protegidas do estresse oxidativo. Eles também fornecem documentação de que o mtHyPer7 pode fornecer uma leitura quantitativa para H 2 O2mitocondrial com resolução celular e subcelular em leveduras em brotamento. Figura 8: O nível mitocondrial H 2 O2é menor na célula filha. (A) Projeção máxima de uma imagem ratiométrica de mtHyPer7 em uma célula representativa. Pseudocolor indica a razão mtHyPer7 oxidada:reduzida (escala na parte inferior). Diferenças subcelulares na razão são evidentes (pontas de setas). Barra de escala = 1 μm. Contorno da célula: branco. (B) Diferença entre a razão mtHyPer7 na gema e na célula-mãe. Para cada célula individual, o valor da razão mãe foi subtraído do valor da razão de brotamento e plotado como um ponto. n = 193 células agrupadas de cinco experimentos independentes, mostradas com símbolos de cores diferentes para cada experimento. Média ± EPM da diferença entre a razão mtHyPer7 nas células mãe e gema: -0,04297 ± 0,01266. p = 0,0008 (teste t pareado) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Tabela suplementar S1: Cepas utilizadas neste estudo. Lista de estirpes de leveduras utilizadas. Clique aqui para baixar este arquivo. Tabela Suplementar S2: Plasmídeos utilizados neste estudo. Lista de plasmídeos utilizados. Clique aqui para baixar este arquivo. Tabela Suplementar S3: Primers utilizados neste estudo. Lista de primers utilizados. Clique aqui para baixar este arquivo. Arquivo Suplementar 1: Protocolo para construção de plasmídeos biossensores. Clique aqui para baixar este arquivo. Arquivo suplementar 2: Scripts para análise automatizada. Para cada script, arquivos de entrada de exemplo e arquivos de saída são fornecidos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Neste protocolo, um método é descrito para usar mtHyPer7 como biossensor para avaliar a mitocôndria H 2 O₂em células vivas de leveduras em brotamento. O biossensor é construído usando um método baseado em CRISPR e introduzido em uma região conservada livre de genes no genoma da levedura sem o uso de marcadores selecionáveis. Em comparação com os biossensores transportados por plasmídeos, os integrados são expressos em todas as células e em níveis consistentes, fornecendo resultados de quantificação mais confiáveis. Nenhum marcador selecionável é usado para gerar células que expressam mtHyPer7, o que permite o uso de uma gama mais ampla de fundos de cepa e facilita a modificação genética de células que expressam biossensores. A proteína mtHyPer7 é corretamente direcionada para as mitocôndrias sem efeitos perceptíveis na morfologia, função, distribuição ou taxas de crescimento celular mitocondriais. mtHyPer7 mostra uma resposta dose-dependente para H 2 O₂adicionado externamente. Além disso, o mtHyPer7 é capaz de relatar a heterogeneidade da qualidade mitocondrial com resolução subcelular. Finalmente, o uso de um microscópio confocal de disco giratório em oposição à microscopia de campo largo para obter imagens de biossensores direcionados para mitocôndrias causa menos fotoclareamento aos fluoróforos e gera imagens de alta resolução para analisar diferenças subcelulares.

Limitações e abordagens alternativas
Este método não é adequado para imagens de células por mais de 10 min, pois as células secarão sob a lamínula. Para exames de imagem a longo prazo, é melhor usar o método de almofada de ágar⁴⁶ ou imobilizar células em uma placa de cultura com fundo de vidro preenchida com meio SC.

A escolha do biossensor deve ser guiada pela concentração do alvo em condições experimentais. Se a sensibilidade do HyPer7 for muito alta, uma versão diferente do HyPer seria recomendada, como HyPer3 ou HyPerRed^47,48. No entanto, deve-se notar que outras sondas HyPer são mais sensíveis ao pH. Para maior sensibilidade, a roGFP à base de peroxirredoxina pode ser mais apropriada (roGFP2Tsa2ΔCR)²⁷.

O estado estacionário de oxidação do sensorH 2 O₂ está ligado às taxas de oxidação e redução. A taxa de oxidação dos biossensores é causada principalmente porH 2 O₂, mas a taxa de redução depende dos sistemas de redução antioxidante ativos na célula e organela. Foi demonstrado que HyPer7 é predominantemente reduzido pelo sistema tiorredoxina no citosol de levedura, e sua redução é mais rápida do que a de roGFP2Tsa2ΔCR²⁷. Portanto, os diferentes mecanismos de redução e dinâmica de resposta da sonda devem ser levados em consideração na interpretação das medidas dos biossensores H 2 O₂. Em particular, para inferir os níveis de H 2O₂a partir da leitura do biossensor, deve-se assumir que o sistema de redução mantém uma capacidade constante durante o experimento. Como alternativa aos scripts aqui descritos, uma variedade de outros softwares foi disponibilizada gratuitamente para a análise de sensores^redox49.

Etapas críticas
Com qualquer biossensor, é fundamental demonstrar que o biossensor em si não afeta o processo que está sendo medido. Portanto, comparar o crescimento e a morfologia mitocondrial das linhagens sob cada condição experimental é importante. Aqui, a morfologia mitocondrial é avaliada usando o MitoTracker Red, que cora as mitocôndrias de maneira dependente do potencial de membrana. No entanto, a comparação das mitocôndrias em células não transformadas e transformadas por biossensores pode ser realizada pela coloração com éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM), um corante vital mitocondrial alternativo sensível ao potencial de membrana, ou MitoTracker Green, que cora as mitocôndrias independentemente do potencial de membrana. Se houver suspeita de efeitos deletérios, reduzir o nível de expressão ou alterar o site de integração pode ajudar.

A validação do comportamento dose-resposta da sonda e da relação sinal-ruído da técnica de imagem também é essencial para a obtenção de resultados robustos. Se a variabilidade dentro de um grupo excede a variabilidade entre os grupos, as diferenças tornam-se difíceis de detectar. A variabilidade intragrupo pode resultar da variação populacional real ou do ruído no processo de detecção. As principais etapas para aumentar a relação sinal:ruído são aquisição de imagem (faixa de valor de pixel e ruído), subtração de fundo e limiarização.

Os efeitos do ruído também podem ser reduzidos durante as etapas de cálculo. A abordagem mais simples é calcular a intensidade média ponderada a partir das medidas de imagem de razão (Results.csv), onde cada pixel representa a razão local entre as eficiências de excitação. Isso produz uma proporção “pixelwise”. No entanto, se a relação sinal:ruído da imagem for baixa, resultados mais robustos podem ser obtidos calculando-se a intensidade média ponderada para uma ROI tanto no numerador quanto no denominador e, em seguida, calculando-se a razão entre essas duas médias ponderadas (“regionalmente”).

Para selecionar um método de limite, o comando Fiji Image | Ajustar | O Auto Threshold pode ser usado para tentar automaticamente todos os métodos internos de Fiji. Para avaliar a segmentação (limiar), uma máscara salva é convertida em uma seleção clicando em Editar | Seleção | Criar seleção, adicionado ao ROI Manager (pressionando T) e, em seguida, ativado no arquivo de imagem bruto. Se as mitocôndrias não forem adequadamente detectadas, um método de segmentação diferente deve ser tentado.

Ao comparar imagens, é essencial adquirir todas as imagens com condições de imagem idênticas, bem como exibir todas as imagens com realce de contraste idêntico.

O movimento mitocondrial deve ser considerado na otimização das condições de imagem. Se as mitocôndrias se moverem significativamente entre a excitação em 405 e 488 nm, a imagem de razão não será precisa. Recomenda-se manter o tempo de exposição <500 ms e alterar a excitação pelo método mais rápido disponível (por exemplo, um pulso de disparo ou filtro ajustável acusto-óptico). Ao capturar uma pilha Z, ambas as excitações devem ser realizadas para cada etapa Z antes de passar para a próxima etapa Z.

Para a exibição dos resultados, mudanças na tonalidade (cor) são mais óbvias para o olho humano do que mudanças na intensidade. Portanto, o valor da razão é convertido em uma escala de cores para facilitar a interpretação visual. As imagens coloridas podem ser não moduladas, onde todos os pixels mitocondriais aparecem no mesmo brilho, ou moduladas em intensidade, onde a intensidade de pixels na imagem original é usada para definir intensidades na imagem colorida.

Modificação e solução de problemas
Como alternativa para confirmar a função mitocondrial por desafio com paraquat, as células podem ser replicadas ou inoculadas em fontes de carbono fermentáveis e não fermentáveis.

Para subtração em segundo plano, subtração de bola rolante (navegando até Processo | Subtrair fundo…) também pode ser usado para remover a não uniformidade da iluminação. Deve-se garantir que a presença de células não altere o plano de fundo que está sendo subtraído (marcando a opção Criar plano de fundo e examinando o resultado).

Em resumo, a sonda mtHyPer7 fornece um método consistente e minimamente invasivo para relacionar o estado morfológico e funcional de mitocôndrias de leveduras em células vivas, e permite o estudo de um importante estressor celular e molécula de sinalização em um sistema modelo geneticamente tratável e de fácil acesso.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem a Katherine Filpo Lopez pela assistência técnica especializada. Este trabalho foi apoiado por subsídios do National Institutes of Health (NIH) (GM122589 e AG051047) para LP.

Esses estudos usaram o recurso compartilhado de microscopia confocal e especializada do Herbert Irving Comprehensive Cancer Center da Universidade de Columbia, financiado em parte pelo NIH/NCI Cancer Center Support Grant P30CA013696.

Materials

100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens	Nikon	MRD01905
Adenine sulfate	Sigma-Aldrich	#A9126
Bacto Agar	BD Difco	#DF0145170
Bacto Peptone	BD Difco	#DF0118170
Bacto Tryptone	BD Difco	#DF211705
Bacto Yeast Extract	BD Difco	#DF0127179
BamHI	New England Biolabs	R0136S
BglII	New England Biolabs	R0144S
Carbenicilin	Sigma-Aldrich	C1389
Carl Zeiss Immersol Immersion Oil	Carl Zeiss	444960
Dextrose (D-(+)-Glucose)	Sigma-Aldrich	#G8270
E. cloni 10G chemical competent cell	Bioserch Technologies	60108
FIJI	NIH		Schindelin et al 2012
G418 (Geneticin)	Sigma-Aldrich	A1720
GFP emission filter	Chroma		525/50
Gibson assembly	New England Biolabs	E2611
Graphpad Prism 7	GraphPad		https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
H₂O₂ (stable)	Sigma-Aldrich	H1009
HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO	Pon Lab	JYE057/EP41	Liao et al 20201
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific	E24
KAPA HiFi PCR kit	Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA	KK1006
L-arginine hydrochloride	Sigma-Aldrich	#A8094
laser	Agilent		405 and 488 nm
L-histidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	#H5659
L-leucine	Sigma-Aldrich	#L8912
L-lysine hydrochloride	Sigma-Aldrich	#L8662
L-methionine	Sigma-Aldrich	#M9625
L-phenylalanine	Sigma-Aldrich	#P5482
L-tryptophan	Sigma-Aldrich	#T8941
L-tyrosine	Sigma-Aldrich	#T8566
mHyPer7 plasmid	This study	JYE116
Microscope coverslips	ThermoScientific	3406	#1.5 (170 µm thickness)
Microscope slides	ThermoScientific	3050
MitoTracker Red CM-H2Xros	ThermoFisherScientific	M7513
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NEBuilder HiFi Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2621
Nikon Elements	Nikon		Microscope acquisition software
Nikon Ti Eclipse inverted microscope	Nikon
Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate)	Sigma-Aldrich	Cat. #856177
RStudio	Posit.co	Free desktop version
Spectrophotometer	Beckman	BU530
Stagetop incubator	Tokai Hit	INU
Uracil	Sigma-Aldrich	#U1128
Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids	BD Difco	#DF0919073
YN2_1_LT58_X2site	Addgene	177705	Pianale et al 2021
Zyla 4.2 sCMOS camera	Andor

References

vander Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).
McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: more than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
Shi, R., Hou, W., Wang, Z. -. Q., Xu, X. Biogenesis of iron-sulfur clusters and their role in DNA metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 735678 (2021).
McFaline-Figueroa, J. R., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).
Higuchi-Sanabria, R., et al. Mitochondrial anchorage and fusion contribute to mitochondrial inheritance and quality control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 27 (5), 776-787 (2016).
Higuchi-Sanabria, R., et al. Role of asymmetric cell division in lifespan control in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 14 (8), 1133-1146 (2014).
Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells. Free Radical Biology & Medicine. 50 (8), 963-970 (2011).
Laun, P., et al. Aged mother cells of Saccharomyces cerevisiae show markers of oxidative stress and apoptosis. Molecular Microbiology. 39 (5), 1166-1173 (2001).
Doudican, N. A., Song, B., Shadel, G. S., Doetsch, P. W. Oxidative DNA damage causes mitochondrial genomic instability in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 25 (12), 5196-5204 (2005).
Roca-Portoles, A., Tait, S. W. G. Mitochondrial quality control: from molecule to organelle. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3853-3866 (2021).
Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative stress. Annual Review of Biochemistry. 86, 715-748 (2017).
Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
Imlay, J. A., Fridovich, I. Assay of metabolic superoxide production in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (11), 6957-6965 (1991).
Fridovich, I. Mitochondria: are they the seat of senescence. Aging Cell. 3 (1), 13-16 (2004).
Quinlan, C. L., Perevoshchikova, I. V., Hey-Mogensen, M., Orr, A. L., Brand, M. D. Sites of reactive oxygen species generation by mitochondria oxidizing different substrates. Redox Biology. 1 (1), 304-312 (2013).
Griendling, K. K., Minieri, C. A., Ollerenshaw, J. D., Alexander, R. W. Angiotensin II stimulates NADH and NADPH oxidase activity in cultured vascular smooth muscle cells. Circulation Research. 74 (6), 1141-1148 (1994).
Griendling, K. K., Sorescu, D., Ushio-Fukai, M. NAD(P)H oxidase: role in cardiovascular biology and disease. Circulation Research. 86 (5), 494-501 (2000).
Edmondson, D. E., Binda, C., Wang, J., Upadhyay, A. K., Mattevi, A. Molecular and mechanistic properties of the membrane-bound mitochondrial monoamine oxidases. Biochemistry. 48 (20), 4220-4230 (2009).
Ramsay, R. R., Singer, T. P. The kinetic mechanisms of monoamine oxidases A and B. Biochemical Society Transactions. 19 (1), 219-223 (1991).
Ramsay, R. R. Kinetic mechanism of monoamine oxidase A. Biochemistry. 30 (18), 4624-4629 (1991).
Handy, D. E., Loscalzo, J. Redox regulation of mitochondrial function. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (11), 1323-1367 (2012).
Wood, Z. A., Schröder, E., Robin Harris, J., Poole, L. B. Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins. Trends in Biochemical Sciences. 28 (1), 32-40 (2003).
Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
Topell, S., Hennecke, J., Glockshuber, R. Circularly permuted variants of the green fluorescent protein. FEBS Letters. 457 (2), 283-289 (1999).
Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Methods. 3 (4), 281-286 (2006).
Kritsiligkou, P., Shen, T. K., Dick, T. P. A comparison of Prx- and OxyR-based H2O2 probes expressed in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100866 (2021).
Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11241-11246 (1999).
Abedi, M. R., Caponigro, G., Kamb, A. Green fluorescent protein as a scaffold for intracellular presentation of peptides. Nucleic Acids Research. 26 (2), 623-630 (1998).
Onukwufor, J. O., et al. A reversible mitochondrial complex I thiol switch mediates hypoxic avoidance behavior in C. elegans. Nature Communications. 13 (1), 2403 (2022).
Vega, M., et al. Antagonistic effects of mitochondrial matrix and intermembrane space proteases on yeast aging. BMC Biology. 20 (1), 160 (2022).
Torello Pianale, L., Rugbjerg, P., Olsson, L. Real-time monitoring of the yeast intracellular state during bioprocesses with a toolbox of biosensors. Frontiers in Microbiology. 12, 802169 (2022).
Imani, M., Mohajeri, N., Rastegar, M., Zarghami, N. Recent advances in FRET-based biosensors for biomedical applications. Analytical Biochemistry. 630, 114323 (2021).
Zadran, S., et al. Fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensors: visualizing cellular dynamics and bioenergetics. Applied Microbiology and Biotechnology. 96 (4), 895-902 (2012).
Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
Liao, P. -. C., Wolken, D. M. A., Serrano, E., Srivastava, P., Pon, L. A. Mitochondria-associated degradation pathway (MAD) function beyond the outer membrane. Cell Reports. 32 (2), 107902 (2020).
Higuchi-Sanabria, R., Swayne, T. C., Boldogh, I. R., Pon, L. A. Live-cell imaging of mitochondria and the actin cytoskeleton in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1365, 25-62 (2016).
Liao, P. -. C., Yang, E. J., Pon, L. A. Live-cell imaging of mitochondrial redox state in yeast cells. STAR Protocols. 1 (3), 100160 (2020).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
Chazotte, B. Labeling mitochondria with MitoTracker dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 990-992 (2011).
Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, T. Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis. Science. 299 (5613), 1751-1753 (2003).
Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nyström, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants can be suppressed by overproducing the protein aggregation-remodeling factor Hsp104p. Genes & Development. 21 (19), 2410-2421 (2007).
Erjavec, N., Cvijovic, M., Klipp, E., Nyström, T. Selective benefits of damage partitioning in unicellular systems and its effects on aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (48), 18764-18769 (2008).
Erjavec, N., Nyström, T. Sir2p-dependent protein segregation gives rise to a superior reactive oxygen species management in the progeny of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (26), 10877-10881 (2007).
Davidson, R., Liu, Y., Gerien, K. S., Wu, J. Q. Real-time visualization and quantification of contractile ring proteins in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1369, 9-23 (2016).
Bilan, D. S., et al. HyPer-3: a genetically encoded H2O2 probe with improved performance for ratiometric and fluorescence lifetime imaging. ACS Chemical Biology. 8 (3), 535-542 (2013).
Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5 (1), 5222 (2014).
Fricker, M. D. Quantitative redox imaging software. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 752-762 (2016).
Yang, E. J., Pernice, W. M., Pon, L. A. A role for cell polarity in lifespan and mitochondrial quality control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. iSCIENCE. 25 (3), 103957 (2022).

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Yang, E. J., Boldogh, I. R., Ji, H., Pon, L., Swayne, T. C. Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells. J. Vis. Exp. (196), e65428, doi:10.3791/65428 (2023).

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