El peróxido de hidrógeno (H2O2) es tanto una fuente de daño oxidativo como una molécula de señalización. Este protocolo describe cómo medir el H 2 O2mitocondrial utilizando HyPer7 dirigido a mitocondrias (mtHyPer7), un biosensor radiométrico codificado genéticamente, en levaduras vivas. Detalla cómo optimizar las condiciones de obtención de imágenes y realizar análisis cuantitativos celulares y subcelulares utilizando software de libre acceso.
La disfunción mitocondrial, o alteración funcional, se encuentra en muchas enfermedades y afecciones, incluidos los trastornos neurodegenerativos y musculoesqueléticos, el cáncer y el envejecimiento normal. Aquí, se describe un enfoque para evaluar la función mitocondrial en células de levadura vivas a resoluciones celulares y subcelulares utilizando un biosensor radiométrico mínimamente invasivo codificado genéticamente. El biosensor, HyPer7 (mtHyPer7), detecta el peróxido de hidrógeno (H2O2) en las mitocondrias. Consiste en una secuencia de señales mitocondriales fusionada a una proteína fluorescente permutada circularmente y el dominio de respuestaH 2 O2 de una proteína bacteriana OxyR. El biosensor se genera e integra en el genoma de la levadura utilizando un sistema libre de marcadores CRISPR-Cas9, para una expresión más consistente en comparación con las construcciones transmitidas por plásmidos.
mtHyPer7 está dirigido cuantitativamente a las mitocondrias, no tiene ningún efecto detectable sobre la tasa de crecimiento de la levadura o la morfología mitocondrial, y proporciona una lectura cuantitativadel H 2 O2 mitocondrial en condiciones normales de crecimiento y tras la exposición al estrés oxidativo. Este protocolo explica cómo optimizar las condiciones de obtención de imágenes utilizando un sistema de microscopio confocal de disco giratorio y realizar análisis cuantitativos utilizando software de libre acceso. Estas herramientas permiten recopilar información espacio-temporal sobre las mitocondrias tanto dentro de las células como entre las células de una población. Además, el flujo de trabajo descrito aquí se puede utilizar para validar otros biosensores.
Las mitocondrias son orgánulos celulares eucariotas esenciales que son bien conocidos por su función en la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa y el transporte de electrones1. Además, las mitocondrias son sitios para el almacenamiento de calcio, la síntesis de lípidos, aminoácidos, ácidos grasos y grupos de hierro-azufre, y la transducción de señales 2,3. Dentro de las células, las mitocondrias forman una red dinámica con morfología y distribución características, que varía según el tipo de célula y el estado metabólico. Además, aunque las mitocondrias pueden fusionarse y dividirse, no todas las mitocondrias de una célula son equivalentes. Numerosos estudios han documentado la heterogeneidad funcional de las mitocondrias dentro de las células individuales en atributos como el potencial de membrana y el estado oxidativo 4,5,6. Esta variación en la función mitocondrial se debe en parte al daño al orgánulo por mutaciones en el ADNmt (que ocurren a un ritmo mayor que en el ADN nuclear) y al daño oxidativo por especies reactivas de oxígeno (ROS) generadas tanto dentro como fuera del orgánulo 7,8,9. El daño al orgánulo se mitiga mediante mecanismos de control de calidad mitocondrial que reparan el daño o eliminan las mitocondrias que están dañadas sin posibilidad de reparación10.
El peróxido de hidrógeno (H2O2) es una especie reactiva de oxígeno que es una fuente de daño oxidativo a las proteínas celulares, ácidos nucleicos y lípidos. Sin embargo, elH2O2también sirve como una molécula de señalización que regula las actividades celulares a través de la oxidación reversible de los tioles en las proteínas diana11,12. ElH2O2se produce a partir de electrones que se escapan de la cadena de transporte de electrones mitocondrial y por enzimas específicas, como la NADPH oxidasa y las monoaminooxidasas 13,14,15,16,17,18,19,20. También es inactivado por los sistemas antioxidantes, incluidos los basados en tiorredoxina y glutatión21,22,23. Por lo tanto, el análisis de los niveles mitocondriales deH2O2es fundamental para comprender el papel de este metabolito en la función mitocondrial y celular normal y en condiciones de estrés oxidativo.
El objetivo general de este protocolo es detectar el H 2 O 2 mitocondrial utilizando un biosensor radiométrico H 2 O2 codificado genéticamente, HyPer7, que está dirigido al orgánulo (mtHyPer7). mtHyPer7 es una quimera que consiste en la secuencia de señal mitocondrial de ATP9 (la presecuencia Su9), una forma permutada circularmente de proteína verde fluorescente (GFP) y el dominio de unión H2 O2 de la proteína OxyR de Neisseria meningitidis24 (Figura 1). En la GFP permutada circularmente, los extremos N y C de la GFP nativa se fusionan y se forman nuevos terminales cerca del cromóforo, lo que confiere una mayor movilidad a la proteína y una mayor labilidad de sus características espectrales en comparación con la GFP25 nativa. La interacción del dominio OxyR de mtHyPer7 con H 2 O 2 es de alta afinidad, H 2 O 2-selectivo, yconduce a la oxidación reversible de los residuos de cisteína conservados y a la formación de puentes disulfuro. Los cambios conformacionales asociados con la oxidación de OxyR se transfieren a la GFP permutada circularmente en mtHyPer7, lo que da como resultado un cambio espectral en el máximo de excitación del cromóforo mtHyPer7 de 405 nm en el estado reducido a 488 nm en el estado H 2O 2-oxidado 26. Por lo tanto, la relación de fluorescencia de mtHyPer7 en respuesta a la excitación a 488 nm frente a 405 nm refleja la oxidación de la sonda porH2O2.
Idealmente, un biosensor debería proporcionar una lectura cuantitativa, absoluta y en tiempo real de su molécula objetivo. Sin embargo, desafortunadamente, esto no siempre es posible en las mediciones del mundo real. En el caso de los sensores de oxidación, como mtHyPer7, la lectura en tiempo real se ve afectada por la tasa de reducción del puente disulfuro. Los sistemas de reducción utilizados por los biosensores ROS difieren, y estos pueden alterar drásticamente la dinámica de respuesta de la sonda, como lo demuestra la comparación de HyPer7, reducido por el sistema de tiorredoxina, y roGFP2-Tsa2ΔCR, reducido por glutatión, en el citosolde levadura 27. Por lo tanto, para sacar una conclusión sobre la concentraciónrelativa de H2O2 a partir de las proporciones mtHyPer7, se debe suponer que el sistema de reducción mantiene una capacidad constante durante el experimento. A pesar de estas consideraciones, HyPer7 y las sondas relacionadas se han utilizado en diversos contextos para obtener información sobre H2O2en células vivas25,28,29.
Figura 1: Diseño, mecanismo molecular y espectros de excitación/emisión del biosensor H 2 O2 mtHyPer7. (A) La sonda mtHyPer7 se obtiene insertando GFP permutada circularmente en el dominio OxyR-RD de Neisseria meningitidis. Contiene la secuencia de diana mitocondrial de la subunidad 9 de la ATP sintasa de Neurospora crassa (Su9). (B) Ilustración del mecanismo de detección de H 2 O2de mtHyPer7. La oxidación de cisteínas en el dominio RD aumenta la emisión de fluorescencia tras la excitación a 488 nm y disminuye la emisión producida por la excitación a 405 nm. (C) Espectros de excitación y emisión de HyPer7 en formas oxidadas y reducidas. Esta figura se reproduce con permiso de Pak et al.24. Abreviaturas: GFP = proteína verde fluorescente; cpGFP = GFP permutada circularmente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Esta imagen radiométrica de mtHyPer7 ofrece importantes beneficiospara la cuantificación mitocondrial de H2O2 24,27; Proporciona un control interno para la concentración de la sonda. Además, el cambio en el pico de excitación producido por laexposición a H2O2 no es completo, incluso en concentraciones saturadas deH2O2. Por lo tanto, las imágenes de relación pueden aumentar la sensibilidad mediante la incorporación de dos puntos espectrales en el análisis.
La sonda mtHyPer7 utilizada aquí tiene una afinidad muy alta por elH2O2y una sensibilidad relativamente baja al pH24, y se ha dirigido con éxito a las mitocondrias30 de Caenorhabditis elegans. Esta proteína también se ha utilizado en levaduras 27,31. Sin embargo, estudios anteriores se basaron en la expresión transmitida por plásmidos de mtHyPer7, lo que da lugar a una variabilidad de célula a célula en la expresión de la sonda27. Además, el constructo descrito en este protocolo se integró en una región conservada y libre de genes en el cromosoma X32 utilizando un enfoque basado en CRISPR para la integración sin marcadores. La expresión del gen biosensor integrado también está controlada por el promotor constitutivo fuerte de TEF1 (Figura 2). Como resultado, hay una expresión más estable y consistente del biosensor en las poblaciones de células de levadura en comparación con la observada utilizando la expresión del biosensor transmitido por plásmidos, y las células que llevan el biosensor se pueden propagar sin la necesidad de medios selectivos.
Figura 2: Generación de células que expresan mtHyPer7 mediante CRISPR. La construcción del biosensor que contiene Cas9 y sgRNA (YN2_1_LT58_X2site) y la construcción del biosensor que contiene mtHyPer7 amplificada por PCR se introducen en células de levadura en ciernes mediante transformación de acetato de litio. El sitio de inserción libre de genes en el cromosoma X (X2) es reconocido y cortado por la proteína Cas9 con el sgRNA, y el biosensor se integra en el genoma por recombinación homóloga. Después de la identificación de los transformantes exitosos mediante cribado microscópico, PCR de colonias y secuenciación, el plásmido Cas9 se elimina (se cura) mediante el crecimiento en medios no selectivos. Abreviaturas: sgRNA = ARN guía simple; TEF = factor potenciador de la transcripción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Por último, mtHyPer7 ofrece ventajas sobre otros biosensores ROS. Por ejemplo, los colorantes orgánicos utilizados para detectar ROS (por ejemplo, dihidroetidio [DHE]2 y MitoSOX3) pueden producir tinciones desiguales o inespecíficas y, a menudo, se administran en disolventes como el etanol o el dimetilsulfóxido, que requieren controles adicionales para los efectos de los disolventes. Otra clase de biosensores ROS son los biosensores basados en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) (por ejemplo, Redoxfluor para el estado redoxcelular 4 y los sensores de peróxido HSP-FRET5, OxyFRET 6 y PerFRET6). Estas sondas están codificadas genéticamente y son altamente sensibles en principio y pueden dirigirse cuantitativamente a las mitocondrias utilizando secuencias de señales mitocondriales bien caracterizadas. Sin embargo, existen desafíos en el uso de sondas basadas en FRET, incluido el fondo debido a la excitación cruzada y el sangrado, y los estrictos requisitos para la proximidad y orientación de los fluoróforos para que ocurra FRET33,34. Además, las sondas FRET consisten en dos proteínas fluorescentes que requieren construcciones más grandes para su expresión en células de interés en comparación con las sondas de cambio de espectro. El protocolo descrito aquí se desarrolló para aprovechar las fortalezas del biosensor basado en HyPer7 y para utilizar esta sonda compacta, ratiométrica, de alta afinidad y codificada genéticamente para obtener imágenes cuantitativas del peróxido en las mitocondrias en levaduras vivas.
En este protocolo, se describe un método para usar mtHyPer7 como biosensor para evaluar el H 2 O2mitocondrial en células de levadura vivas en ciernes. El biosensor se construye utilizando un método basado en CRISPR y se introduce en una región libre de genes conservada en el genoma de la levadura sin el uso de marcadores seleccionables. En comparación con los biosensores transmitidos por plásmidos, los integrados se expresan en todas las células y a niveles consistentes, lo que proporciona resultados de cuantificación más fiables. No se utilizan marcadores seleccionables para generar células que expresen mtHyPer7, lo que permite el uso de una gama más amplia de antecedentes de cepas y facilita la modificación genética de las células que expresan biosensores. La proteína mtHyPer7 se dirige correctamente a las mitocondrias sin efectos notables en la morfología, función, distribución o tasas de crecimiento celular mitocondriales. mtHyPer7 muestra una respuesta dependiente de la dosis alH2O22 añadido externamente. Además, mtHyPer7 es capaz de informar sobre la heterogeneidad de la calidad mitocondrial con resolución subcelular. Por último, el uso de un microscopio confocal de disco giratorio en lugar de una microscopía de campo amplio para obtener imágenes de biosensores dirigidos a mitocondrias provoca menos fotoblanqueo en los fluoróforos y genera imágenes de alta resolución para analizar las diferencias subcelulares.
Limitaciones y enfoques alternativos
Este método no es adecuado para obtener imágenes de células durante más de 10 minutos, ya que las células se secarán debajo del cubreobjetos. Para obtener imágenes a largo plazo, es mejor utilizar el método de la almohadilla de agar46 o inmovilizar las células en una placa de cultivo con fondo de vidrio llena de medio SC.
La elección del biosensor debe guiarse por la concentración de la diana en condiciones experimentales. Si la sensibilidad de HyPer7 es demasiado alta, se recomienda una versión diferente de HyPer, como HyPer3 o HyPerRed47,48. Sin embargo, hay que tener en cuenta que otras sondas HyPer son más sensibles al pH. Para una mayor sensibilidad, podría ser más apropiado el roGFP basado en peroxirredoxina (roGFP2Tsa2ΔCR)27.
El estado estacionario de oxidación del sensorH 2 O2 está vinculado tanto a las tasas de oxidación como a las de reducción. La tasa de oxidación de los biosensores es causada principalmente porH2O2, pero la tasa de reducción depende de los sistemas de reducción antioxidante activos en la célula y el orgánulo. Se ha demostrado que HyPer7 es predominantemente reducido por el sistema de tiorredoxina en el citosol de levadura, y su reducción es más rápida que la de roGFP2Tsa2ΔCR27. Por lo tanto, los diferentes mecanismos de reducción y dinámica de respuesta de la sonda deben tenerse en cuenta al interpretar las mediciones de los biosensores deH2O2. En particular, para inferir los nivelesde H 2 O2 a partir de la lectura del biosensor, se debe suponer que el sistema de reducción mantiene una capacidad constante durante el experimento. Como alternativa a los scripts aquí descritos, se ha puesto a disposición una variedad de otros programas informáticos para el análisis de sensores redox49.
Pasos críticos
Con cualquier biosensor, es fundamental demostrar que el biosensor en sí mismo no afecta el proceso que se está midiendo. Por lo tanto, es importante comparar el crecimiento y la morfología mitocondrial de las cepas en cada condición experimental. Aquí, la morfología mitocondrial se evalúa utilizando MitoTracker Red, que tiñe las mitocondrias de una manera dependiente del potencial de membrana. Sin embargo, la comparación de las mitocondrias en células no transformadas y transformadas por biosensores se puede lograr mediante la tinción con éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM), un colorante vital mitocondrial alternativo que detecta el potencial de membrana, o MitoTracker Green, que tiñe las mitocondrias independientemente del potencial de membrana. Si se sospecha de efectos nocivos, puede ser útil reducir el nivel de expresión o cambiar el sitio de integración.
La validación del comportamiento dosis-respuesta de la sonda y la relación señal-ruido de la técnica de imagen también son esenciales para obtener resultados sólidos. Si la variabilidad dentro de un grupo excede la variabilidad entre grupos, las diferencias se vuelven difíciles de detectar. La variabilidad intragrupo puede ser el resultado de una variación poblacional real o de ruido en el proceso de detección. Los pasos clave para aumentar la relación señal:ruido son la adquisición de imágenes (rango de valores de píxeles y ruido), la sustracción de fondo y el umbral.
Los efectos de ruido también se pueden reducir durante los pasos de cálculo. El enfoque más sencillo es calcular la intensidad media ponderada a partir de las mediciones de la imagen de relación (Resultados.csv), donde cada píxel representa la relación local entre las eficiencias de excitación. Esto produce una relación “píxel”. Sin embargo, si la relación señal:ruido de la imagen es baja, se pueden obtener resultados más robustos calculando la intensidad media ponderada para un ROI tanto en el numerador como en los canales del denominador, y luego calculando la relación entre estas dos medias ponderadas (relación “por región”).
Para seleccionar un método de umbral, el comando Fiji Imagen | Ajustar | El umbral automático se puede utilizar para probar automáticamente todos los métodos de Fiji incorporados. Para evaluar la segmentación (umbral), una máscara guardada se convierte en una selección haciendo clic en Editar | Selección | Crear selección, agregada al Administrador de ROI (presionando T) y luego activada en el archivo de imagen sin procesar. Si las mitocondrias no se detectan adecuadamente, se debe intentar un método de segmentación diferente.
Al comparar imágenes, es esencial adquirir todas las imágenes con condiciones de imagen idénticas, así como mostrar todas las imágenes con una mejora de contraste idéntica.
El movimiento mitocondrial debe tenerse en cuenta a la hora de optimizar las condiciones de obtención de imágenes. Si las mitocondrias se mueven significativamente entre la excitación a 405 y 488 nm, la imagen de relación no será precisa. Se recomienda mantener el tiempo de exposición <500 ms y cambiar la excitación por el método más rápido disponible (por ejemplo, un pulso de disparo o un filtro sintonizable acústico-óptico). Al capturar una pila Z, ambas excitaciones deben realizarse para cada paso Z antes de pasar al siguiente paso Z.
Para la visualización de los resultados, los cambios en el tono (color) son más obvios para el ojo humano que los cambios en la intensidad. Por lo tanto, el valor de la relación se convierte en una escala de colores para facilitar la interpretación visual. Las imágenes coloreadas pueden ser no moduladas, en las que todos los píxeles mitocondriales aparecen con el mismo brillo, o moduladas por intensidad, en las que la intensidad de píxeles de la imagen original se utiliza para establecer intensidades en la imagen coloreada.
Modificación y solución de problemas
Como alternativa a la confirmación de la función mitocondrial mediante provocación con paraquat, las células pueden ser replicadas o inoculadas en fuentes de carbono fermentables y no fermentables.
Para la sustracción de fondo, la resta de bolas rodantes (navegando a Proceso | Restar fondo…) También se puede utilizar para eliminar la falta de uniformidad de la iluminación. Debe asegurarse de que la presencia de celdas no altere el fondo que se está restando (marcando la opción Crear fondo y examinando el resultado).
En resumen, la sonda mtHyPer7 proporciona un método consistente y mínimamente invasivo para relacionar el estado morfológico y funcional de las mitocondrias de levadura en células vivas, y permite el estudio de un importante factor de estrés celular y molécula de señalización en un sistema modelo genéticamente tratable y de fácil acceso.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a Katherine Filpo López por su asistencia técnica experta. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) (GM122589 y AG051047) a LP.
En estos estudios se utilizó el recurso compartido de microscopía confocal y especializada del Centro Oncológico Integral Herbert Irving de la Universidad de Columbia, financiado en parte a través de la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico de los NIH/NCI P30CA013696.
100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens | Nikon | MRD01905 | |
Adenine sulfate | Sigma-Aldrich | #A9126 | |
Bacto Agar | BD Difco | #DF0145170 | |
Bacto Peptone | BD Difco | #DF0118170 | |
Bacto Tryptone | BD Difco | #DF211705 | |
Bacto Yeast Extract | BD Difco | #DF0127179 | |
BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
BglII | New England Biolabs | R0144S | |
Carbenicilin | Sigma-Aldrich | C1389 | |
Carl Zeiss Immersol Immersion Oil | Carl Zeiss | 444960 | |
Dextrose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | #G8270 | |
E. cloni 10G chemical competent cell | Bioserch Technologies | 60108 | |
FIJI | NIH | Schindelin et al 2012 | |
G418 (Geneticin) | Sigma-Aldrich | A1720 | |
GFP emission filter | Chroma | 525/50 | |
Gibson assembly | New England Biolabs | E2611 | |
Graphpad Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
H2O2 (stable) | Sigma-Aldrich | H1009 | |
HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO | Pon Lab | JYE057/EP41 | Liao et al 20201 |
Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | E24 | |
KAPA HiFi PCR kit | Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK1006 | |
L-arginine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #A8094 | |
laser | Agilent | 405 and 488 nm | |
L-histidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #H5659 | |
L-leucine | Sigma-Aldrich | #L8912 | |
L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #L8662 | |
L-methionine | Sigma-Aldrich | #M9625 | |
L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | #P5482 | |
L-tryptophan | Sigma-Aldrich | #T8941 | |
L-tyrosine | Sigma-Aldrich | #T8566 | |
mHyPer7 plasmid | This study | JYE116 | |
Microscope coverslips | ThermoScientific | 3406 | #1.5 (170 µm thickness) |
Microscope slides | ThermoScientific | 3050 | |
MitoTracker Red CM-H2Xros | ThermoFisherScientific | M7513 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NEBuilder HiFi Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621 | |
Nikon Elements | Nikon | Microscope acquisition software | |
Nikon Ti Eclipse inverted microscope | Nikon | ||
Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate) | Sigma-Aldrich | Cat. #856177 | |
RStudio | Posit.co | Free desktop version | |
Spectrophotometer | Beckman | BU530 | |
Stagetop incubator | Tokai Hit | INU | |
Uracil | Sigma-Aldrich | #U1128 | |
Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids | BD Difco | #DF0919073 | |
YN2_1_LT58_X2site | Addgene | 177705 | Pianale et al 2021 |
Zyla 4.2 sCMOS camera | Andor |