Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Emily Jie-Ning Yang; Istvan R. Boldogh; Haojie Ji; Liza Pon; Theresa C. Swayne

doi:10.3791/65428

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biology

Beeldvorming van mtHyPer7, een ratiometrische biosensor voor mitochondriaal peroxide, in levende gistcellen

Published: June 02, 2023

doi:

10.3791/65428

Emily Jie-Ning Yang¹, Istvan R. Boldogh^1,2, Haojie Ji², Liza Pon^1,2, Theresa C. Swayne^1,2

¹Department of Pathology and Cell Biology,Columbia University Irving Medical Center, ²Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource in the Herbert Irving Comprehensive Cancer Center,Columbia University Irving Medical Center

Summary

Waterstofperoxide (_H2O₂) is zowel een bron van oxidatieve schade als een signaalmolecuul. Dit protocol beschrijft hoe mitochondriale H 2 O₂kan worden gemeten met behulp van mitochondriën-gerichte HyPer7 (mtHyPer7), een genetisch gecodeerde ratiometrische biosensor, in levende gist. Het beschrijft hoe beeldvormingsomstandigheden kunnen worden geoptimaliseerd en kwantitatieve cellulaire en subcellulaire analyses kunnen worden uitgevoerd met behulp van vrij beschikbare software.

Abstract

Mitochondriale disfunctie, of functionele verandering, wordt aangetroffen bij veel ziekten en aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve en musculoskeletale aandoeningen, kanker en normale veroudering. Hier wordt een benadering beschreven om de mitochondriale functie in levende gistcellen te beoordelen bij cellulaire en subcellulaire resoluties met behulp van een genetisch gecodeerde, minimaal invasieve, ratiometrische biosensor. De biosensor, mitochondriëngericht HyPer7 (mtHyPer7), detecteert waterstofperoxide (H 2 O₂) in mitochondriën. Het bestaat uit een mitochondriale signaalsequentie die is gefuseerd met een circulair gepermuteerd fluorescerend eiwit en het H2O2-responsieve domein van een bacterieel OxyR-eiwit. De biosensor wordt gegenereerd en geïntegreerd in het gistgenoom met behulp van een CRISPR-Cas9-markervrij systeem, voor een consistentere expressie in vergelijking met door plasmiden overgedragen constructies.

mtHyPer7 is kwantitatief gericht op mitochondriën, heeft geen detecteerbaar effect op de groeisnelheid van gist of mitochondriale morfologie, en biedt een kwantitatieve uitlezing voor mitochondriaal H 2 O₂onder normale groeiomstandigheden en bij blootstelling aan oxidatieve stress. Dit protocol legt uit hoe de beeldvormingsomstandigheden kunnen worden geoptimaliseerd met behulp van een confocaal microscoopsysteem met draaiende schijf en hoe kwantitatieve analyses kunnen worden uitgevoerd met behulp van vrij beschikbare software. Deze tools maken het mogelijk om rijke spatiotemporele informatie over mitochondriën te verzamelen, zowel binnen cellen als tussen cellen in een populatie. Bovendien kan de hier beschreven workflow worden gebruikt om andere biosensoren te valideren.

Introduction

Mitochondriën zijn essentiële eukaryote cellulaire organellen die bekend staan om hun functie bij het produceren van ATP door oxidatieve fosforylering en elektronentransport^. Bovendien zijn mitochondriën plaatsen voor calciumopslag, de synthese van lipiden, aminozuren, vetzuren en ijzer-zwavelclusters en signaaltransductie ^2,3. Binnen cellen vormen mitochondriën een dynamisch netwerk met karakteristieke morfologie en distributie, die varieert afhankelijk van het celtype en de metabolische toestand. Bovendien, hoewel mitochondriën kunnen samensmelten en delen, zijn niet alle mitochondriën in een cel gelijkwaardig. Talrijke studies hebben de functionele heterogeniteit van mitochondriën binnen individuele cellen gedocumenteerd in attributen zoals membraanpotentiaal en oxidatieve toestand ^4,5,6. Deze variatie in mitochondriale functie is gedeeltelijk te wijten aan schade aan het organel door mtDNA-mutaties (die sneller optreden dan in nucleair DNA) en aan oxidatieve schade door reactieve zuurstofsoorten (ROS) die zowel binnen als buiten het organel worden gegenereerd ^7,8,9. Schade aan het organel wordt beperkt door mitochondriale kwaliteitscontrolemechanismen die de schade herstellen of mitochondriën elimineren die onherstelbaar beschadigd zijn¹⁰.

Waterstofperoxide (H 2O₂) is een reactieve zuurstofsoort die een bron is van oxidatieve schade aan cellulaire eiwitten, nucleïnezuren en lipiden. _H2_O2 dient echter ook als een signaalmolecuul dat cellulaire activiteiten reguleert door de omkeerbare oxidatie van thiolen in doeleiwitten^11,12. H 2 O₂wordt geproduceerd uit elektronen die lekken uit de mitochondriale elektronentransportketen en door specifieke enzymen, zoals NADPH-oxidase en monoamine-oxidasen 13,14,15,16,17,18,19,20. Het wordt ook geïnactiveerd door antioxidantsystemen, waaronder die op basis van thioredoxine en glutathion^21,22,23. Analyse van mitochondriale_H2O 2-spiegelsis dus van cruciaal belang voor het begrijpen van de rol van deze metaboliet in de normale mitochondriale en cellulaire functie en onder omstandigheden van oxidatieve stress.

Het algemene doel van dit protocol is om mitochondriaal H 2 O 2 te detecteren met behulp van een genetisch gecodeerde ratiometrische H 2 O₂ biosensor, HyPer7, die gericht is op het organel (mtHyPer7). mtHyPer7 is een chimaera die bestaat uit de mitochondriale signaalsequentie van ATP9 (de Su9-presequentie), een circulair gepermuteerde vorm van groen fluorescerend eiwit (GFP), en het H 2 O_2-bindendedomein van het OxyR-eiwit van Neisseria meningitidis²⁴ (Figuur 1). In circulair gepermuteerd GFP worden de N- en C-termini van native GFP gefuseerd en worden nieuwe termini gevormd in de buurt van de chromofoor, die een grotere mobiliteit aan het eiwit en een grotere labiliteit van zijn spectrale kenmerken geven in vergelijking met native GFP²⁵. De interactie van het OxyR-domein van mtHyPer7 met H 2 O 2 is zeer affiniteit, H 2 O_2-selectiefen leidt tot omkeerbare oxidatie van de geconserveerde cysteïneresiduen en de vorming van disulfidebruggen. Conformatieveranderingen geassocieerd met de oxidatie van OxyR worden overgebracht naar het circulair gepermuteerde GFP in mtHyPer7, wat resulteert in een spectrale verschuiving in het excitatiemaximum van de mtHyPer7-chromofoor van 405 nm in gereduceerde toestand tot 488 nm in de H 2 O_{2-geoxideerde} toestand²⁶. De verhouding tussen fluorescentie van mtHyPer7 als reactie op excitatie bij 488 nm versus 405 nm weerspiegelt dus de oxidatie van de sonde door H 2 O₂.

Idealiter zou een biosensor een real-time, absolute, kwantitatieve uitlezing van zijn doelmolecuul moeten geven. Helaas is dit echter niet altijd mogelijk in metingen in de praktijk. In het geval van oxidatiesensoren, zoals mtHyPer7, wordt de real-time uitlezing beïnvloed door de reductiesnelheid van de disulfidebrug. De reductiesystemen die door ROS-biosensoren worden gebruikt, verschillen, en deze kunnen de dynamiek van de sonderespons drastisch veranderen, zoals blijkt uit de vergelijking van HyPer7, gereduceerd door het thioredoxinesysteem, en roGFP2-Tsa2ΔC_R, gereduceerd door glutathion-in gistcytosol²⁷. Om een conclusie te trekken over de relatieve H2_{O2-concentratie}uit mtHyPer7-verhoudingen, moet men dus aannemen dat het reductiesysteem tijdens het experiment een constante capaciteit handhaaft. Niettegenstaande deze overwegingen zijn HyPer7 en verwante sondes in verschillende contexten gebruikt om informatie te verkrijgen over H 2 O₂in levende cellen^25,28,29.

Figuur 1: Ontwerp, moleculair mechanisme en excitatie/emissiespectra vande H 2 O₂ biosensor mtHyPer7. (A) De mtHyPer7-sonde wordt afgeleid door circulair gepermuteerd GFP in het OxyR-RD-domein in te brengen van Neisseria meningitidis. Het bevat de mitochondriale targetingsequentie van subeenheid 9 van de ATP-synthase van Neurospora crassa (Su9). (B) Illustratie van het H 2 O_{2-detectiemechanisme}van mtHyPer7. Oxidatie van cysteïnen in het RD-domein verhoogt de fluorescentie-emissie bij excitatie bij 488 nm en vermindert de emissie geproduceerd door excitatie bij 405 nm. (C) Excitatie- en emissiespectra van HyPer7 in geoxideerde en gereduceerde vorm. Deze figuur is overgenomen met toestemming van Pak et ^al.24. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; cpGFP = circulair gepermuteerd GFP. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Deze ratiometrische beeldvorming van mtHyPer7 biedt belangrijke voordelen voor mitochondriale_H2O₂ kwantificering^24,27; Het biedt een interne controle voor de sondeconcentratie. Bovendien is de verschuiving van de excitatiepiek die wordt veroorzaaktdoor blootstelling aan H2 O2 niet volledig, zelfs niet bij verzadigingsconcentraties van H2_O2. Ratio-beeldvorming kan dus de gevoeligheid verhogen door twee spectrale punten in de analyse op te nemen.

De mtHyPer7-sonde die hier wordt gebruikt, heeft een zeer hoge affiniteit voor H 2 O₂en een relatief lage gevoeligheid voor pH²⁴, en is met succes gericht op Caenorhabditis elegans mitochondriën³⁰. Dit eiwit is ook gebruikt in gist^27,31. Eerdere studies waren echter gebaseerd op plasmide-gedragen expressie van mtHyPer7, wat resulteert in cel-tot-cel variabiliteit in sonde-expressie²⁷. Bovendien werd het construct dat in dit protocol wordt beschreven, geïntegreerd in een geconserveerd, genvrij gebied op chromosoom X³² met behulp van een op CRISPR gebaseerde benadering voor markervrije integratie. De expressie van het geïntegreerde biosensorgen wordt ook gecontroleerd door de sterke constitutieve TEF1-promotor (Figuur 2). Als gevolg hiervan is er een stabielere, consistentere expressie van de biosensor in gistcelpopulaties in vergelijking met die waargenomen met behulp van plasmide-gedragen biosensorexpressie, en kunnen cellen met de biosensor worden vermeerderd zonder dat selectieve media nodig zijn.

Figuur 2: Generatie van mtHyPer7-expressieve cellen door CRISPR. Het Cas9- en sgRNA-bevattende plasmide (YN2_1_LT58_X2site) en PCR-geamplificeerde mtHyPer7-bevattende biosensorconstruct worden in ontluikende gistcellen geïntroduceerd door transformatie van lithiumacetaat. De genvrije insertieplaats op chromosoom X (X2) wordt herkend en geknipt door Cas9-eiwit met het sgRNA, en de biosensor wordt geïntegreerd in het genoom door homologe recombinatie. Na identificatie van de succesvolle transformanten door microscopische screening, kolonie-PCR en sequencing, wordt het Cas9-plasmide verwijderd (genezen) door groei in niet-selectieve media. Afkortingen: sgRNA = single guide RNA; TEF = transcriptieversterker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tot slot biedt mtHyPer7 voordelen ten opzichte van andere ROS-biosensoren. Organische kleurstoffen die worden gebruikt om ROS te detecteren (bijv. dihydroethidium [DHE]² en MitoSOX³) kunnen bijvoorbeeld ongelijkmatige of niet-specifieke kleuring veroorzaken en worden vaak geleverd in oplosmiddelen zoals ethanol of dimethylsulfoxide, waarvoor aanvullende controles op oplosmiddeleffecten nodig zijn. Een andere klasse van ROS-biosensoren zijn biosensoren op basis van fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) (bijv. Redoxfluor voor cellulaire redoxtoestand⁴ en de peroxidesensoren HSP-FRET⁵, OxyFRET 6 en PerFRET⁶). Deze sondes zijn genetisch gecodeerd en in principe zeer gevoelig en kunnen kwantitatief worden gericht op mitochondriën met behulp van goed gekarakteriseerde mitochondriale signaalsequenties. Er zijn echter uitdagingen bij het gebruik van FRET-gebaseerde sondes, waaronder achtergrond als gevolg van cross-excitatie en bleed-through, en strenge eisen voor de nabijheid en oriëntatie van de fluoroforen om FRET te laten optreden^33,34. Bovendien bestaan FRET-sondes uit twee fluorescerende eiwitten die grotere constructen nodig hebben voor expressie in cellen van belang in vergelijking met spectra-verschuivende sondes. Het hier beschreven protocol is ontwikkeld om te profiteren van de sterke punten van de op HyPer7 gebaseerde biosensor en om deze compacte, ratiometrische, genetisch gecodeerde sonde met hoge affiniteit te gebruiken voor kwantitatieve beeldvorming van peroxide in mitochondriën in levende gist.

Protocol

1. Generatie van het biosensorplasmide, integratie in het gistgenoom en beoordeling van de targeting van mtHyPer7 op mitochondriën en effecten op mitochondriale morfologie, cellulaire groeisnelheden of oxidatieve stressgevoeligheid NOTITIE: Raadpleeg Aanvullend bestand 1, Aanvullende tabel S1, Aanvullende tabel S2 en Aanvullende tabel S3 voor respectievelijk de constructie van biosensorplasmiden, stammen, plasmiden en primers die worden gebruikt voor de constructie en karakterisering van biosensoren. Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt. Amplificeer het biosensorconstruct van het biosensorplasmide met behulp van de primers Y290 en Y291 (Figuur 2) via polymerasekettingreactie (PCR). Meng 500 ng van het Cas9/gids-RNA-plasmide (YN2_1_LT58_X2site32) met 50 μL van het PCR-product uit stap 1.1 (het biosensorconstruct). Transformeer het mengsel in ontluikende gist met behulp van de lithiumacetaatmethode35 en selecteer transformatoren op YPD-platen die 200 mg/ml G418 bevatten. Screening van kandidaat-transformanten door PCR-amplificatie van genoom-DNA met behulp van de primers Y292 en Y293. Voor transformatoren met een inzetstuk van de verwachte grootte (positief: 3,5 kb; negatief: 0,3 kb), volgt u de volgorde van het ingevoegde gebied voor verdere validatie. Evalueer het effect van de biosensor op de groei en de mitochondriale functie (Figuur 3). Als de biosensor de functie van cellen of mitochondriën lijkt te beïnvloeden, probeer dan het effect te minimaliseren door de promotor, integratieplaats of ouderstam te veranderen.Bepaal het effect van het biosensorconstruct op de groeisnelheid in de aan- en afwezigheid van een oxidatieve stressor (bijv. paraquat), zoals eerder beschreven36.Verdun cellen in de midlogfase tot een optische dichtheid van 600 nm (OD 600) van 0,0035 in200 μl corresponderende media met en zonder behandeling in elk putje van een vlakke bodemplaat met 96 putjes. Meet de optische dichtheid van de cultuur elke 20 min gedurende 72 uur met behulp van een plaatlezer. Bereken de maximale groeisnelheid (helling) als de maximale verandering in OD over een interval van 240 minuten tijdens de cursus van 72 uur. Visualiseer de cellen door middel van fluorescentiemicroscopie en evalueer de helderheid en mitochondriale morfologie zoals eerder beschreven37.Laat de cellen groeien tot de mid-log-fase, kleur de mitochondriën gedurende 30 minuten met 250 nM MitoTracker Red en was ze twee keer voordat u beeldvorming maakt. Leg Z-stapels met een diepte van 6 μm vast met intervallen van 0,3 μm op een breedveld- of confocale fluorescentiemicroscoop en inspecteer ze visueel. Zoek naar mitochondriën die langwerpige buisvormige structuren vormen. Figuur 3: mtHyPer7 is gericht op mitochondriën en heeft geen invloed op de mitochondriale morfologie, celgroei of gevoeligheid voor oxidatieve stress. (A) Mitochondriale morfologie in levende gistcellen die mtHyPer7 tot expressie brengen. Linkerpaneel: mtHyPer7 gevisualiseerd met 488 nm excitatie. Middenpaneel: mitochondriën gelabeld met 250 nM MitoTracker Red. Rechterpaneel: samengevoegde afbeeldingen. Er worden projecties met maximale intensiteit weergegeven. De celomtrek wordt in het wit weergegeven. Schaalbalk = 1 μm. (B,C) Groeicurven en maximale groeisnelheid van wildtype cellen en cellen die mtHyPer7 tot expressie brengen, gekweekt in aanwezigheid (+PQ) of afwezigheid van 2,5 mM paraquat in YPD-media. (D,E) Groeicurven en maximale groeisnelheid van wildtype en mtHyPer7-expressieve cellen gekweekt in aanwezigheid (+PQ) of afwezigheid van 2,5 mM paraquat in SC-media. Alle groeicurven zijn het middel van drie onafhankelijke replicaten. Maximale groeisnelheden worden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Analyse van de groeicurve werd uitgevoerd door cellen in de midlogfase te verdunnen tot een OD 600 van 0,0035 in200 μL corresponderende media in elk putje van een vlakke bodemplaat met 96 putjes. De OD van de cultuur werd gedurende 72 uur elke 20 minuten gemeten met behulp van een plaatlezer. Elke stam/aandoening werd in drievoud geplateerd en de gemiddelde groeisnelheid werd uitgezet. De maximale groeisnelheid (helling) werd berekend aan de hand van de veranderingen in OD over een interval van 240 minuten in de loop van 72 uur. Afkortingen: WT = wildtype; PQ = paraquat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 2. Celkweek en voorbereiding voor beeldvorming (figuur 4) Vermeerder de cellen in synthetisch medium naar de mid-log-fase voor beeldvorming. Een mid-logfasekweek van 5 ml levert voldoende cellen op voor vier of vijf objectglaasjes en in totaal >100 ontluikende cellen voor analyse.Bereid ‘s ochtends de dag voor het experiment vloeibare voorculturen voor door 5 ml synthetisch compleet (SC) medium te inoculeren in een buis met conische bodem van 50 ml met een enkele kolonie gistcellen. Incubeer de voorcultuur in een orbitale schudder bij 200 tpm en 30 °C gedurende 6-8 uur. Meet de OD 600 van de voorcultuur, die zich in de mid-log-fase moet bevinden: ~0,5-1 × 107 cellen/ml, OD600 ~0,1-0,3. Bereid de volgende dag een cultuur in het midden van de logfase voor met behulp van de voorcultuur voor beeldvorming. Bereken de hoeveelheid voorcultuur die nodig is voor een cultuur in het midden van de logfase na een nachtelijke groei (8-16 uur). Wanneer de cellen in SC-medium worden gekweekt, is de verdubbelingstijd ~ 2 uur. Daarom wordt het volume (V) van de voorcultuur voor inoculatie van een nachtelijke cultuur van 5 ml berekend met behulp van vergelijking (1):(1) Inoculeer 5 ml SC-medium in een buis van 50 ml met conische bodem met de hoeveelheid voorcultuur berekend in stap 2.1.3. Kweek in een orbitale schudder bij 200 tpm en 30 °C gedurende 8-16 uur. Controleer op de dag van de beeldvorming of de in stap 2.1.4 gegenereerde kweek zich in de midlogfase bevindt (OD600 ~0,1-0,3). Concentreer de cellen van 1 ml van de mid-log fasecultuur door centrifugatie bij 6.000 × g gedurende 30 s. Verwijder het supernatant en laat 10-20 μL van het supernatans in de buis. Resuspendeer de celpellet door voorzichtig te mengen met restmedia met behulp van een micropipet. Gebruik een luchtblazer of een pluisvrije tissue om stof van een glazen microscoopglaasje te verwijderen en voeg 1,8 μL van de celsuspensie toe aan het objectglaasje. Bedek de cellen met een #1.5 (170 μm dik) glazen dekglaasje en laat het dekglaasje langzaam schuin zakken om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan. Maak onmiddellijk een afbeelding en gooi het glaasje weg na 10 minuten beeldvorming. Figuur 4: Celgroei en beeldvorming. Ontluikende gistcellen die mtHyPer7 tot expressie brengen, worden gekweekt tot de mid-log-fase. Beelden uit de Z-serie worden verzameld door middel van confocale microscopie van de draaiende schijf en vervolgens onderworpen aan 3D-reconstructie en -analyse. Zie protocolparagrafen 2-3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 3. Optimalisatie van beeldvormingscondities en beeldverzameling (Figuur 5) Selecteer een beeldvormingsmodus. Voor optische doorsnede zonder nabewerking wordt de voorkeur gegeven aan een confocaal instrument met een spinning-disk. Als het signaal echter zwak is of als dit instrument niet beschikbaar is, gebruik dan groothoekbeeldvorming en zorg ervoor dat de breedveldbeelden worden gedeconvolueerd om onscherpe onscherpte te verwijderen, zoals eerder beschreven38. Selecteer optiek. Gebruik een olie-immersielens met een hoge numerieke apertuur, zoals 100x/1.45 Plan-Apochromat. Selecteer excitatie- en emissiegolflengten. Gebruik voor confocale beeldvorming van de draaiende schijf een laserexcitatie bij 405 nm en 488 nm en een standaard GFP-emissiefilter. Gebruik voor breedveldbeeldvorming een lichtgevende diode (LED) of lampexcitatie, maar zorg ervoor dat de filteropstelling variatie van de excitatie toestaat terwijl de emissie door het standaard GFP-filter wordt geleid.OPMERKING: Dit kan bijvoorbeeld worden bereikt door het excitatiefilter uit een GFP-kubus te verwijderen en een LED of filterwiel te gebruiken om de excitatie te selecteren. Selecteer de belichtingstijd en verlichtingsintensiteit.Stel acquisitievoorwaarden vast die een gemakkelijk detecteerbaar signaal en een acceptabele resolutie in elk fluorescentiekanaal opleveren. Gebruik bijvoorbeeld op een confocale microscoop met een draaiende schijf met een sCMOS-camera 2 x 2 binning, 20-40 % laservermogen en 200-600 ms belichting. Bestudeer het histogram van de afbeelding. Zorg er in een 12-bits afbeelding (4.096 mogelijke grijswaarden) voor dat het totale dynamische bereik van de pixelwaarden ten minste enkele honderden grijsniveaus bedraagt, zonder verzadiging (Figuur 5A). Zorg er bovendien voor dat het bereik een orde van grootte hoger is dan het geluidsniveau. Bereken het ruisniveau als de standaarddeviatie van pixelwaarden in een celvrij gebied van een afbeelding, gemeten zoals beschreven in stap 4.1.3.1. Test op fotobleken of door beeldvorming geïnduceerde mitochondriale stress onder de geselecteerde beeldvormingsomstandigheden. Als overmatig fotobleken of een toename van mitochondriaal H 2O2 wordt waargenomen, verminder dan het laservermogen en verhoog de belichting of binning.Verzamel een time-lapse-reeks beelden, zonder vertraging tussen acquisities, om de effecten van de beeldvormingsomstandigheden op signaalstabiliteit en oxidatieve stress in mitochondriën te beoordelen. Meet met behulp van de microscoopacquisitiesoftware of ImageJ de gemiddelde pixelwaarde in elk fluorescentiekanaal om de signaalstabiliteit te bevestigen (<5% verandering; Figuur 5B). Als het experiment geen time-lapse-beeldvorming omvat, zorg er dan voor dat de fluorescentie stabiel is over twee of drie herhaalde Z-stapels (25-35 belichtingen).OPMERKING: Een afname van de fluorescentie van beide kanalen kan duiden op fotobleken; een afname van de 405 nm-geëxciteerde fluorescentie vergezeld van een toename van het 488 nm-geëxciteerde kanaal kan echter wijzen op verhoogde mitochondrialeH2O2 en beeldvormingsgeïnduceerde oxidatieve stress in het organel. Verkrijg afbeeldingen. Als u Z-stapels verzamelt, moet u ervoor zorgen dat het Z-interval hetzelfde is voor alle afbeeldingen in de gegevensset en de hele cel opnemen. Voor ontluikende gist, afbeelding met een Z-interval van 0,5 μm en een totale stapeldiepte van 6 μm. Verkrijg beelden van doorgelaten licht om celgrenzen te documenteren. Analyseer afbeeldingen handmatig of semi-automatisch via de scripts die beschikbaar zijn in Supplemental File 2 en op https://github.com/theresaswayne/biosensor, met behulp van de Fiji-distributie van ImageJ39 en de statistische software R (Figuur 6). In de software-instructies worden hiërarchische menucommando’s vetgedrukt weergegeven met “|”, wat een opeenvolging van menuselecties aangeeft. Opties en knoppen worden vetgedrukt weergegeven. Figuur 5: Optimalisatie van beeldvorming . (A) Evaluatie van beelden en histogrammen voor het juiste intensiteitsbereik. Projecties met maximale intensiteit van confocale beelden van de draaiende schijf worden getoond. De histogrammen worden weergegeven met zowel een lineaire Y-as (zwart) als een log-schaal Y-as (grijs) om het dynamische bereik van het beeld te illustreren. Linkerpanelen: een beeld met ruis met lage intensiteit en dynamisch bereik. Middenpanelen: een afbeelding met een acceptabel dynamisch bereik (~1.000 grijswaarden) en intensiteit. Rechterpanelen: een afbeelding die niet goed contrastrijk is en overmatige verzadiging veroorzaakt. Schaalbalk = 1 μm. (B,C) Analyse van fotobleken van mtHyPer7. Opeenvolgende Z-stapels werden zonder vertraging verzameld, Z-stapels werden opgeteld en de gemiddelde intensiteit van mitochondriën werd gemeten en genormaliseerd naar het eerste tijdstip. De resultaten van de eerste drie tijdstippen (27 belichtingen) worden getoond. (B) Excitatiegolflengte: 405 nm. (C) Excitatiegolflengte: 488 nm. De getoonde waarden zijn de gemiddelden van drie cellen van elk van de drie onafhankelijke onderzoeken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 4. Semi-geautomatiseerde analyse met scripts Genereer en meet verhoudingsafbeeldingen met behulp van een biosensoranalysescript (bijv. biosensor.ijm of biosensor-image-subtraction.ijm).Selecteer het script dat u wilt gebruiken. Het protocol voor het gebruik van elk script is vergelijkbaar; Eventuele verschillen worden in de tekst vermeld.biosensor.ijm: In dit script worden achtergrond en ruis gecorrigeerd met behulp van door de gebruiker geselecteerde afbeeldingsgebieden, vaste waarden of geen aftrekking. Selecteer methoden voor achtergrond- en ruiscorrectie onafhankelijk. biosensor-image-subtraction.ijm: In dit script worden achtergrond en ruis beide verwerkt door dezelfde door de gebruiker geselecteerde methode, die een van de volgende kan zijn: lege afbeelding, door de gebruiker geselecteerd gebied in de afbeelding, vaste waarde of geen correctie. Open in Fiji een meerkanaals Z-stackafbeelding die u in stap 3.5 hebt verkregen. Open het gewenste scriptbestand voor biosensoranalyse. Voer het script uit door te klikken op Uitvoeren in het venster Scripteditor . Voer in het dialoogvenster dat verschijnt de gevraagde informatie in.Selecteer de kanaalnummers van de teller en noemer voor de berekening van de verhouding. Voor mtHyPer7 is de teller het kanaal dat wordt geëxciteerd bij 488 nm en de noemer is het kanaal dat wordt geëxciteerd bij 405 nm. Selecteer het kanaalnummer van het uitgezonden lichtbeeld, indien aanwezig, of 0 als er geen is. Selecteer de gewenste methode voor het aftrekken van de achtergrond uit de volgende vier opties. Als de achtergrond relatief uniform is, kiest u Selecteer een afbeeldingsgebied, waarmee het achtergrondniveau in de afbeelding rechtstreeks wordt gemeten. Als de achtergrond aanzienlijk varieert in het veld, gebruikt u het script biosensor-image-subtraction.ijm en selecteert u Lege afbeelding (om een lege afbeelding te verzamelen voor correctie, legt u een meerkanaals Z-stapel vast met identieke acquisitiecondities in een celvrij gezichtsveld of van een dia die is gemaakt met een celvrij groeimedium). Vaste waarde maakt het mogelijk om een eerder gemeten achtergrondwaarde in te voeren. Geen enkele laat de achtergrond ongecorrigeerd, maar kan de nauwkeurigheid van de meting verminderen. Selecteer de gewenste methode voor het aftrekken van geluid. De ruiswaarde wordt gebruikt als een lagere drempel op de achtergrond afgetrokken, gemaskeerde kanaalbeelden om het effect van willekeurige variatie in de uitlezing van de detector te verminderen. Kies voor Selecteer een beeldgebied of Vaste waarde om een eerder gemeten ruisniveau in te voeren, wat meestal goed werkt omdat de ruisniveaus constant zijn als de beeldvormingsomstandigheden constant worden gehouden. U kunt ook Geen kiezen en een waarde van 1 gebruiken als de onderste drempelwaarde, wat de variabiliteit van de metingen kan vergroten. Selecteer een drempelalgoritme om mitochondriën nauwkeurig en consistent te detecteren; Otsu of MaxEntropy worden aanbevolen. Gebruik idealiter hetzelfde algoritme voor alle afbeeldingen in een experiment, maar zorg voor de nauwkeurige herkenning van mitochondriën. Gebruik een andere drempelmethode als er tijdens een experiment veranderingen in de morfologie optreden. Selecteer het aantal interessegebieden (ROI’s) per cel. Als je bijvoorbeeld de verschillen tussen moeder en knop meet, selecteer je 2. Selecteer de uitvoermap waarin metingen en verhoudingsafbeeldingen worden opgeslagen. Volg de aanwijzingen voor achtergrond – en ruiscorrectie.Gebiedsselectie (indien van toepassing): Als Selecteer een afbeeldingsgebied is gekozen voor achtergrond- of ruismeting, volgt u de aanwijzingen om een achtergrondgebied te tekenen (buiten cellen of fluorescerende artefacten) met behulp van de tool Rechthoekige ROI. Klik na het tekenen van het gebied op OK. Invoer van vaste waarde (indien van toepassing): Als er een vaste waarde is gekozen voor achtergrond- of ruismeting, volg dan de aanwijzingen om achtergrond – en/of ruiswaarden in te voeren voor elk fluorescentiekanaal. Lege referentieafbeelding (indien van toepassing): Als in het script biosensor-image-subtraction.ijm Lege afbeelding is gekozen voor achtergrond- of ruiscorrectie, volgt u de aanwijzingen om een leeg afbeeldingsbestand te selecteren. Markeer ROI’s voor meting. Beperk de analyse in culturen in het midden van de logfase tot cellen in knop.Teken ROI’s die overeenkomen met individuele cellen of subcellulaire regio’s op basis van het helderveldbeeld. De ROI hoeft niet exact overeen te komen met de celomtrek, omdat alleen de gedrempelde mitochondriën binnen de ROI worden gemeten. U kunt ook een eerder opgeslagen ROI-set openen: klik in de ROI-manager op ‘ Meer’ en selecteer vervolgens het ROI-bestand. Druk op T na het maken van elke ROI om de geselecteerde ROI toe te voegen aan de ROI Manager. Vink in de ROI-manager Alles weergeven aan om de gemarkeerde cellen te documenteren. Elke toegevoegde regio wordt weergegeven als een genummerd item in de lijst ROI Manager. Als u meer dan één ROI per cel analyseert (bijv. moeder en knop), markeert u de ROI’s in dezelfde volgorde voor elke geanalyseerde cel. Nadat alle gewenste ROI’s zijn toegevoegd aan de ROI Manager, klikt u op OK in het dialoogvenster Cellen markeren . Kies het formaat van de maattabel. Vink in het dialoogvenster MultiMeasure dat wordt weergegeven de optie Alle segmenten meten aan. Vink de optie Eén rij per segment aan om een tabel met de gewenste indeling te maken. Gebruik de process_multiROI_tables. R-script om tabellen te verwerken die zijn gemaakt met de optie Eén rij per segment; vink Resultaten toevoegen niet aan. Herhaal deze stap 3x (voor het meten van de teller [488], noemer [405] en verhouding [488/405] afbeeldingen). Het script slaat de uitvoerbestanden op in de map die is geselecteerd in stap 4.1.2.6. Berekening van gewogen gemiddelde verhoudingen voor elk gebied of elke celBereken met behulp van de resultaten die in de vorige stap zijn verkregen de gewogen gemiddelde verhoudingen voor elke regio of cel met behulp van vergelijking (2). Bereken de verhoudingen “pixelgewijs” of “regionaal” (zie de discussie voor details).(2)OPMERKING: De oppervlakte- en geïntegreerde dichtheidswaarden (IntDen) omvatten alleen de pixels binnen de drempelige mitochondriën. Deze berekening kan worden geautomatiseerd met behulp van de process_multiROI_tables. R-script en R-statistische software. Genereer een afbeelding met een ingekleurde verhouding. Aangezien veranderingen in tint (kleur) duidelijker zijn voor het menselijk oog dan veranderingen in intensiteit, converteert u de verhoudingswaarde naar een kleurenschaal voor eenvoudigere visuele interpretatie. Het script colorize_ratio_image.ijm kleurt een afbeelding met een gemaskeerde verhouding in.Open in Fiji een Z-stackafbeelding met verhouding die is gegenereerd in stap 4.1.6. Open het scriptbestand colorize_ratio_image.ijm. Voer het script uit door te klikken op Uitvoeren in het venster Scripteditor . Voer in het dialoogvenster dat verschijnt de gevraagde informatie in.Inkleuringsmethode: In de optie Ongemoduleerd verschijnen alle mitochondriale pixels met dezelfde helderheid. Sommige afbeeldingen kunnen echter luidruchtig lijken, omdat zowel zwakke als heldere pixels bijdragen aan de beeldverhouding. Als u dit effect wilt verminderen, gebruikt u de optie Intensiteit gemoduleerd . Minimale en maximale weergegeven waarde: Deze waarden bepalen het bereik van de verhoudingswaarden die worden ingekleurd. Kies waarden die in de buurt liggen van de gemiddelde minimum- en maximumwaarden die in een experiment zijn waargenomen (op basis van de gewogen gemiddelde verhoudingen berekend in stap 4.2.1). Zorg er tijdens een experiment voor dat u alle afbeeldingen met identieke beeldvormingsomstandigheden verkrijgt en dat alle afbeeldingen met identieke minimum- en maximumwaarden worden weergegeven. Projectiemodus: Z-stapels worden weergegeven als projecties om de volledige mitochondriale populatie weer te geven. De projectie wordt gemaakt vóór de inkleuring. Selecteer Max voor een projectie met maximale intensiteit (met behoud van de maximale verhouding en intensiteitswaarden) of Gemiddelde voor een projectie met gemiddelde intensiteit. Uitvoermap: Selecteer de map waarin u de ingekleurde afbeeldingen wilt opslaan. Als de optie Ongemoduleerd is geselecteerd, selecteert u een kleurenschema (opzoektabel; LUT) in het dialoogvenster dat wordt weergegeven. Gebruik de Fire of Rainbow RGB LUT’s die in Fiji zijn ingebouwd, of elke gewenste LUT in het .lut-formaat van ImageJ (Importeren uit LUT-bestand). De Rainbow Smooth40 LUT wordt aanbevolen (opgenomen in Supplemental File 2 en op GitHub). Het script slaat de uitvoerbestanden op in de map die is geselecteerd in stap 4.3.1.4. Deze omvatten de afbeelding met ingekleurde verhouding (Color_RGB.tif) en de afbeelding met gekleurde verhouding met een kalibratiebalk die de overeenkomst tussen verhoudingswaarden en afbeeldingskleur (Color_with_bar.tif) aangeeft. 5. Handmatige analyse OPMERKING: Deze aanpak kost meer tijd, maar biedt flexibiliteit bij de voorbewerking en het instellen van de drempelwaarde. Corrigeer voor achtergrond.Opties instellen in Fiji.Klik op Analyseren | Stel metingen in. Vink in het dialoogvenster dat wordt weergegeven de vakjes aan voor Area, Mean, StdDev, IntDen en Display Label. Stel de decimalen in op 3. Klik op Bewerken | Opties | Invoer/uitgang. Vink in het dialoogvenster dat wordt weergegeven de vakjes aan voor Rijnummers opslaan en Kolomkoppen opslaan. Om de gevoeligheid van de verhoudingsberekening te verhogen, trekt u de achtergrond af van elk fluorescentiekanaal. Als de achtergrond relatief uniform is, meet dan de gemiddelde intensiteit van een celvrij gebied in een afbeelding en trek deze waarde af van de hele afbeelding (stap 5.1.2.1). Als de achtergrond in het veld sterk varieert, kunt u ook een lege afbeelding gebruiken voor correctie (stap 5.1.2.2.).Als u een door de gebruiker geselecteerd gebied wilt aftrekken, klikt u op Afbeelding | Kleur | Splits kanalen en houd alle kanaalafbeeldingen open, omdat ze later nodig zijn. Teken voor elk fluorescentiekanaal een ROI op de achtergrond (buiten eventuele cellen) en klik op Analyseren | Meten of voor stapels klikt u op Afbeelding | Stapels | Stapel meten. Let op de gemiddelde waarde van de ROI die wordt weergegeven in de tabel Resultaten . Klik op Bewerken | Selecteer ‘Geen’ en vervolgens ‘ Verwerken’ | Wiskunde | Aftrekken. Voer in het dialoogvenster dat verschijnt de gemeten gemiddelde achtergrondwaarde in, afgerond op het dichtstbijzijnde gehele getal.OPMERKING: Afronding voorkomt later fouten met binaire bewerkingen. Als u een lege afbeelding wilt aftrekken van een gegevensbestand, verzamelt u een lege afbeelding uit een volledig celvrij gezichtsveld of uit een dia die is gemaakt met een celvrij groeimedium. Klik op Verwerken | Afbeelding Calculator. In het dialoogvenster dat wordt weergegeven, stelt u de bewerking in op Aftrekken en stelt u Afbeelding1 en Afbeelding2 in op respectievelijk de celafbeelding en de lege afbeelding. Vink Nieuw venster maken en 32-bits resultaat aan. Om de analyse te beperken tot mitochondriën, voert u segmentatie uit. Omdat elk kanaal van intensiteit kan veranderen, afhankelijk van de toestand van de biosensor, gebruikt u de som van de twee kanalen om het gebied van mitochondriën consistent te definiëren.Om een somafbeelding te maken, klikt u op Verwerken | Afbeelding Calculator. In het dialoogvenster dat verschijnt, stelt u de bewerking in op Toevoegen en stelt u Afbeelding1 en Afbeelding2 in willekeurige volgorde in op de twee van de achtergrond afgetrokken fluorescerende kanalen. Vink Nieuw venster maken en 32-bits resultaat aan en wacht tot er een somafbeelding verschijnt. Stel de drempelwaarde in om mitochondriën te definiëren op de somafbeelding.Klik op Afbeelding | Aanpassen | Drempel. Vink in het venster Drempel dat verschijnt Donkere achtergrond en Stapelhistogram aan. Stel Method in op het gewenste algoritme (bijv. Otsu of MaxEntropy). Gebruik geautomatiseerde drempelwaarden voor reproduceerbaarheid, maar als er geen automatische methode geschikt is, past u de drempelwaarde handmatig aan.OPMERKING: Idealiter wordt hetzelfde algoritme gebruikt voor alle afbeeldingen in een experiment, maar veranderingen in de morfologie tijdens een experiment kunnen in sommige omstandigheden een andere drempelmethode vereisen. Wanneer de drempelwaarde bevredigend is, klikt u op Toepassen. Kies in het dialoogvenster dat verschijnt de optie Converteren naar masker. Vink in het dialoogvenster dat verschijnt Zwarte achtergrond aan en laat de andere vakjes uitgeschakeld. Sla de resulterende maskerafbeelding op voor evaluatie van de segmentatienauwkeurigheid. Converteer de maskerwaarden van 0 en 255 naar respectievelijk 0 en 1 door te klikken op Verwerken | Wiskunde | Verdelen. Stel de waarde in op 255 en selecteer desgevraagd de optie om alle afbeeldingen te verwerken. Pas het masker toe op de achtergrond-afgetrokken fluorescentiekanalen door te klikken op Verwerken | Afbeelding Calculator. In het dialoogvenster dat verschijnt, stelt u de bewerking in op Vermenigvuldigen. Stel Afbeelding1 en Afbeelding2 in op respectievelijk het tellerkanaal en het masker. Vink Nieuw venster maken en 32-bits resultaat aan; Herhaal de maskervermenigvuldiging met het noemerkanaal. Bereid elk gemaskeerd kanaal voor op de berekening van de verhouding door de achtergrondpixels in te stellen op NaN (“geen getal”).Selecteer het gemaskeerde tellerkanaal en klik op Afbeelding | Aanpassen | Drempel. Klik in het venster Drempelwaarde op Instellen en stel in het dialoogvenster dat wordt weergegeven het minimum in op het berekende geluidsniveau of op 1 en laat het maximum zoals het is. Klik in het venster Drempel op Toepassen. Kies in het volgende dialoogvenster de optie Instellen op NaN. Herhaal dit voor het kanaal van de gemaskeerde noemer. Genereer de verhoudingsafbeelding.Klik op Verwerken | Afbeelding Calculator. Stel in het dialoogvenster dat verschijnt de bewerking in op Delen. Stel Afbeelding1 en Afbeelding2 in op respectievelijk de op de achtergrond afgetrokken gemaskeerde teller- en noemerkanalen. Voor mtHyPer7 is de teller de geoxideerde vorm die wordt geëxciteerd bij 488 nm en de noemer de gereduceerde vorm die wordt geëxciteerd bij 405 nm. Daarom duiden hogere verhoudingen op een hogere H 2 O2. Vink Nieuw venster maken en 32-bits resultaat aan. Sla de afbeelding van de verhouding op voor analyse. Markeer en kwantificeer interessegebieden. Elke cel of subcellulair gebied wordt geselecteerd en opgeslagen als een ROI in de ROI Manager. De ROI’s hoeven niet perfect overeen te komen met de celcontouren, omdat alleen de gemaskeerde mitochondriënregio’s worden gemeten.Gebruik het beeld van doorgelaten licht om vertekening te voorkomen en creëer ROI’s die overeenkomen met individuele cellen (of subcellulaire regio’s). Beperk de analyse in culturen in het midden van de logfase tot gistcellen met knoppen, die actief betrokken zijn bij de celdeling. Druk op T na het maken van elke ROI om deze toe te voegen aan de ROI Manager. Vink Alles weergeven aan om de gemarkeerde cellen te documenteren. Klik op de bovenstaande afbeelding van de verhouding en klik in de ROI-manager op Meer … | MultiMeasure. Vink in het dialoogvenster dat wordt weergegeven de optie Alle segmenten meten aan. Vink Resultaten toevoegen niet aan. Vink de optie Eén rij per segment aan om een tabel met de gewenste indeling te maken. De process_multiROI_tables. Het R-script verwerkt tabellen die zijn gemaakt met de optie Eén rij per segment in de statistische R-software. Sla de resultaten op. Klik op het venster Resultaten en vervolgens op Bestand | Sla de resultatentabel op en sla deze op in .csv of .xls indeling. Stel de bestandsnaam zo in dat deze overeenkomt met de naam van de afbeelding. Sla de ROI’s op. Controleer in de ROI-manager eerst of er geen ROI’s zijn geselecteerd: klik op Deselecteren en vervolgens op Meer | Opslaan. Open de opgeslagen ROI’s samen met de originele afbeelding in Fiji om de metingen te vergelijken met de afbeelding. Bereken de gewogen gemiddelde verhoudingen per cel of gebied met behulp van de resultaten die zijn verkregen in de vorige stap en vergelijking (3). Bereken de verhoudingen “pixelgewijs” of “regionaal” (zie de discussie voor details).(3)OPMERKING: De oppervlakte- en geïntegreerde dichtheidswaarden omvatten alleen de pixels binnen de drempelwaarde mitochondriën. Deze berekening kan worden geautomatiseerd met behulp van de process_multiROI_tables. R-script in de statistische R-software. Genereer een afbeelding met een ingekleurde verhouding.OPMERKING: Ingekleurde afbeeldingen kunnen niet-gemoduleerd zijn, waarbij alle mitochondriale pixels met dezelfde helderheid worden weergegeven, of intensiteitsgemoduleerd, waarbij de pixelintensiteit in de originele afbeelding wordt gebruikt om de intensiteit in de ingekleurde afbeelding in te stellen.Om een ongemoduleerde ingekleurde afbeelding te maken:Open de hierboven gegenereerde verhoudingsafbeelding. Klik op Afbeelding | Dupliceer om een kopie van de afbeelding te genereren en sluit vervolgens de originele afbeelding. Als de afbeelding een Z-stapel is, selecteert u een enkele plak of genereert u een Z-projectie om alle mitochondriën te bekijken. Gebruik een maximale intensiteit (met behoud van de maximale verhouding en intensiteitswaarden op elke XY-pixelcoördinaat) of een projectie met gemiddelde intensiteit. Klik op Afbeelding | Zoek tabellen op en stel de LUT in op het gewenste kleurenschema (bijv. Rainbow RGB of Fire [standaard beschikbaar in ImageJ]). U kunt ook klikken op Bestand | Importeer LUT en selecteer elke gewenste LUT in het .lut-formaat van ImageJ, zoals Rainbow Smooth40 (opgenomen in Supplemental File 2 en op GitHub). Zorg ervoor dat de LUT een donkere kleur heeft die is toegewezen aan de 0-waarde. Stel het weergavecontrast in door te klikken op Afbeelding | Aanpassen | Helderheid/contrast. Klik in het venster Helderheid/contrast op Instellen en voer in het dialoogvenster dat verschijnt de gewenste waarden in voor de weergegeven minimum – en maximumwaarden . Om de waargenomen kleurverschillen te maximaliseren, stelt u deze in op ongeveer het minimum en maximum dat voor alle afbeeldingen wordt verkregen. Stel alle afbeeldingen in een experiment in op dezelfde contrastniveaus.OPMERKING: Klik niet op Toepassen, omdat hierdoor de pixelwaarden worden gewijzigd en in de volgende stap geen nauwkeurige kalibratiebalk wordt gegenereerd. Voeg een kleurkalibratiebalk toe door te klikken op Analyseren | Gereedschap | Kalibratie balk. Vink in het dialoogvenster dat verschijnt de optie Overlay aan om de balk desgewenst te verwijderen door te klikken op Afbeelding | Overlay | Overlay verwijderen. Voeg desgewenst een schaalbalk toe door te klikken op Analyseren | Gereedschap | Schaal balk. Stel in het dialoogvenster dat verschijnt de gewenste grootte, locatie en kleur voor de balk in. Vink de optie Overlay aan om de kleur van de balk te behouden, ongeacht de gebruikte LUT. Genereer een RGB-afbeelding voor publicatie door te klikken op Afbeelding | Overlay | Afvlakken. Sla de resulterende afbeelding op.OPMERKING: Deze afbeelding is alleen bedoeld voor presentatie of publicatie. De intensiteitswaarden zijn gewijzigd, zodat het niet kan worden gemeten. De balken worden ook permanent op het beeld gebrand. Om een beeld met intensiteitsmodulatie te maken:Klik op Afbeelding | Dupliceren om een kopie van de afbeelding te genereren en sluit vervolgens het origineel. Als de afbeelding een Z-stapel is, selecteert u een enkele plak of genereert u een Z-projectie om alle mitochondriën te bekijken. Stel het weergavecontrast van de verhoudingsafbeelding in door te klikken op Afbeelding | Aanpassen | Helderheid/contrast en klik in het venster Helderheid/contrast op Instellen. Voer in het dialoogvenster dat verschijnt de gewenste waarden in voor de weergegeven minimum – en maximumwaarden . Om de waargenomen kleurverschillen te maximaliseren, stelt u deze in op ongeveer het minimum en maximum dat voor alle afbeeldingen wordt verkregen en stelt u alle afbeeldingen in een experiment in op dezelfde contrastniveaus. Klik op Toepassen om de pixelwaarden opnieuw te schalen. Als u een kalibratiebalk wilt maken, dupliceert u deze verbeterde afbeelding en genereert u een balk door te navigeren naar Analyseren | Gereedschap | Kalibratie staaf. Converteer de afbeelding en overlay naar RGB-formaat door te klikken op Afbeelding | Overlay | Afvlakken. Plak deze balk desgewenst op de intensiteitsgemoduleerde RGB-afbeelding die in stap 5.6.2.12 is verkregen voor presentatie of publicatie. Maak een nieuwe afbeelding met dezelfde breedte en hoogte als de afbeelding door te klikken op Bestand | Nieuw | Afbeelding…. Stel in het dialoogvenster dat wordt geopend de parameters als volgt in: Type: RGB; Vul met: Zwart; Breedte en hoogte: 9breedte en hoogte van de afbeelding); Plakjes: 1. Converteer de nieuwe stapel naar een HSB-afbeeldingsstapel (tint, verzadiging, helderheid) door te klikken op Afbeelding | Soort | HSB-stapel. Klik op de afbeelding met de voor contrast aangepaste verhouding door te navigeren naar Bewerken | Selecteer Alles en vervolgens Bewerken | Kopiëren. Klik vervolgens op de HSB-stapel, selecteer de eerste slice (Hue) en klik op Bewerken | Plakken om de verhoudingswaarden over te brengen. Selecteer segment 2 (Verzadiging) van de HSB-stapel. Stel de voorgrondkleur in op wit door te navigeren naar Bewerken | Opties | Kleuren. Klik op Bewerken | Selecteer Alles en vervolgens Bewerken | Vullen en selecteer in het dialoogvenster dat wordt geopend Nee om alleen het huidige segment met wit te vullen. Open de afbeelding met onbewerkte gegevens en splits de kanalen door te klikken op Afbeelding | Kleur | Kanalen splitsen. Genereer het gemiddelde van de twee verhoudingskanalen met behulp van de Image Calculator en klik op Proces | Afbeelding Calculator. Stel in het dialoogvenster dat wordt weergegeven de bewerking in op Gemiddelde en stel Afbeelding1 en Afbeelding2 in op respectievelijk de teller – en noemerafbeeldingen. Vink Nieuw venster maken aan. Klik op de gemiddelde afbeelding die hierboven is gemaakt door te navigeren naar Bewerken | Selecteer Alles en vervolgens Bewerken | Kopiëren. Klik vervolgens op de HSB-stapel, selecteer het derde segment (Waarde) en klik op Bewerken | Plakken om de intensiteitswaarden over te brengen. Converteer de HSB-stack naar de RGB-kleurruimte door te klikken op Afbeelding | Soort | RGB-kleur. Sla de resulterende afbeelding op. Figuur 6: Schema van beeldanalyse en presentatie. Confocale beelden van de spinschijf worden eerst van de achtergrond afgetrokken. Mitochondriën worden gesegmenteerd door drempels en omgezet in maskers voor elk plakje. Deze maskers worden op beide kanalen toegepast en de gemaskeerde afbeeldingen worden gebruikt om de verhoudingsafbeelding te berekenen. ROI’s worden getrokken om de mtHyPer7-ratio in cellen of subcellulaire regio’s te meten. Afbeeldingen met een ingekleurde verhouding kunnen ook worden gegenereerd voor gegevenspresentatie. Schaalbalk = 1 μm. Afkorting: ROI = regio van belang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Representative Results

Om te bevestigen dat mtHyPer7 een geschikte sonde is om mitochondriaal H 2 O2te beoordelen, werden de lokalisatie van mtHyPer7 en het effect ervan op gistmitochondriën en celgezondheid beoordeeld. Om de targeting van mtHyPer7 te beoordelen, werden mitochondriën gekleurd met de vitale mitochondriën-specifieke kleurstof MitoTracker Red in controlegistcellen en gist die mtHyPer7 tot expressie brengen. Met behulp van MitoTracker Red-kleuring werden mitochondriën opgelost als lange buisvormige structuren die langs de moeder-knop-as waren uitgelijnd en zich ophoopten in de punt van de knop en de punt van de moedercel distaal van de knop41. De mitochondriale morfologie was vergelijkbaar in de controlecellen en de mtHyPer7-expressiecellen. Bovendien is mtHyPer7 co-gelokaliseerd met MitoTracker Roodgekleurde mitochondriën (Figuur 3A). MtHyPer7 was dus efficiënt en kwantitatief gericht op mitochondriën zonder de normale mitochondriale morfologie of distributie te beïnvloeden. Vervolgens werden aanvullende validatie-experimenten uitgevoerd om het effect van mtHyPer7 op cellulaire fitheid en gevoeligheid voor oxidatieve stress in mitochondriën te beoordelen. De groeisnelheden van mtHyPer7-expressiecellen in rijke of synthetische op glucose gebaseerde media (respectievelijk YPD of SC) zijn vergelijkbaar met die van niet-getransformeerde wildtypecellen (Figuur 3B,D). Om de mogelijke effecten op oxidatieve stress in mitochondriën te beoordelen, werden controle- en mtHyPer7-expressieve gist behandeld met lage niveaus van paraquat, een redox-actief klein molecuul dat zich ophoopt in mitochondriën en resulteert in verhoogde superoxideniveaus in het organel24,27. Als mtHyPer7-expressie oxidatieve stress in mitochondriën induceert of mitochondriën beschermt tegen oxidatieve stress, dan zouden mtHyPer7-expressiecellen respectievelijk een verhoogde of verlaagde gevoeligheid voor paraquatbehandeling moeten vertonen. Behandeling met lage niveaus van paraquat resulteerde in een afname van de gistgroeisnelheid. Bovendien waren de groeisnelheden van wildtype en mtHyPer7-expressieve cellen in aanwezigheid van paraquat vergelijkbaar (Figuur 3C,E). Daarom veroorzaakte de expressie van de biosensor geen significante cellulaire stress in ontluikende gistcellen of veranderde de gevoeligheid van gist voor mitochondriale oxidatieve stress. Gezien het bewijs dat mtHyPer7 geschikt is voor het bestuderen van mitochondriaal H 2 O 2 in ontluikende gist, werd getest of mtHyPer7 mitochondriale H 2 O 2 kon detecteren in wildtype gist in het midden van de logfase en veranderingen in mitochondriaal H 2 O 2 geïnduceerd door extern toegevoegde H 2 O 2. Er werd een H2O2-titratie-experimentuitgevoerd en de gemiddelde geoxideerde:gereduceerde (O/R) mtHyPer7-verhouding werd gemeten in mitochondriën. De geautomatiseerde analysescripts produceerden verschillende uitvoerbestanden. De beeldverhouding (ratio.tif): Een Z-stapel die bestaat uit de verhouding van de achtergrondgecorrigeerde, drempelige 488 nm- en 405 nm-stapels. Deze stapel kan in Fiji worden bekeken zonder extra verwerking; Het wordt echter aanbevolen om het contrast te verbeteren en/of de afbeelding in te kleuren zoals beschreven in protocolstap 4.3 of 5.6 voordat u de afbeelding bekijkt. Het maskerbeeld (mask.tif): een Z-stapel die bestaat uit de drempelige mitochondriale gebieden die voor analyse worden gebruikt. Deze afbeelding moet worden gebruikt om de nauwkeurigheid van de drempelwaarde te evalueren. De ROI’s die worden gebruikt voor analyse (ROI’s.zip): Wanneer dit bestand wordt geopend in Fiji, samen met de bronafbeelding, worden de ROI’s over de afbeelding heen gelegd om te verwijzen naar de resultatentabel en de bronafbeelding. Elke ROI wordt hernoemd met een celnummer en ROI-nummer. Meettabellen (NumResults.csv, DenomResults.csv, Results.csv) met de oppervlakte, het gemiddelde en de geïntegreerde dichtheid van de gedrempelde mitochondriën voor elke plak in respectievelijk de teller-, noemer- en verhoudingsafbeeldingen. In plakjes waar mitochondriën afwezig of onscherp waren, wordt NaN geregistreerd. Een logbestand (Log.txt) waarin de opties worden gedocumenteerd die worden gebruikt voor achtergrond- en ruiscorrectie, drempelwaarden en verhoudingsberekening. De O/R-ratio van mtHyPer7 vertoonde een dosisafhankelijke respons op de H2 O2-concentratie, die een plateau bereikte bij 1-2 mM extern toegevoegde H2O2 (Figuur 7). Verrassend genoeg was de HyPer7-ratio lager in de cellen die werden blootgesteld aan 0,1 mM H 2O2 dan in de controlecellen, hoewel dit verschil niet statistisch significant was. Een verklaring voor dit fenomeen kan een hormesereactie zijn, waarbij blootstelling aan een laag niveau van stressor stressreacties kan veroorzaken, zoals antioxiderende mechanismen, die op hun beurt de hoeveelheid ROS verlagen die door de sonde kan worden gedetecteerd. Hogere niveaus van stressoren kunnen daarentegen de interne stressreacties overweldigen en resulteren in een hogere uitlezing van HyPer7. Figuur 7: Respons van mtHyPer7 op extern toegevoegde H 2 O 2. (A) Maximale projectie van 405 nm en 488 nm geëxciteerde beelden en projectie van gemiddelde intensiteit van ratiometrische beelden van mtHyPer7 in cellen in het midden van de logfase die zijn blootgesteld aan verschillende concentraties van H 2 O 2. Pseudocolor geeft de verhouding geoxideerd:gereduceerd mtHyPer7 aan (schaal onderaan). Schaalbalk = 1 μm. De celomtrek wordt in het wit weergegeven; n > 100 cellen per aandoening. (B) Kwantificering van de verhouding mtHyPer7 geoxideerd:gereduceerd in ontluikende gistcellen die met verschillende concentraties H 2 O2zijn behandeld. De gemiddelden van vijf onafhankelijke proeven worden getoond, met verschillend gevormde en gekleurde symbolen voor elke proef. Gemiddelde ± SEM van de verhouding geoxideerd:gereduceerd mtHyPer7: 1,794 ± 0,07627 (geen behandeling), 1,357 ± 0,03295 (0,1 mM), 2,571 ± 0,3186 (0,5 mM), 6,693 ± 0,5194 (1 mM), 7,017 ± 0,1197 (2 mM). p < 0,0001 (eenrichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest). P-waarden worden aangeduid als: ****p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Ten slotte toonden eerdere studies aan dat fittere mitochondriën, die meer gereduceerd zijn en minder superoxide bevatten, bij voorkeur worden overgeërfd door gistdochtercellen4, en dat cytosolische catalasen worden getransporteerd naar en geactiveerd in gistdochtercellen42,43,44,45. Deze studies documenteren de asymmetrische overerving van mitochondriën tijdens de deling van gistcellen en een rol voor dit proces in de fitheid en levensduur van dochtercellen, evenals asymmetrie in de leeftijd van moeder en dochter. Om te testen of er verschillen inH 2 O2 bestaan tussen moeders en knoppen, werd mtHyPer7 gemeten in knoppen en moedercellen. Verschillen in mitochondrialeH2O 2 werden waargenomen in gistcellen, en een subtiele maar statistisch significante afname van de uitlezing van de H 2 O2biosensor werd gedetecteerd in mitochondriën in de knop in vergelijking met die in de moedercel (Figuur 8). Deze bevindingen komen overeen met eerdere bevindingen dat mitochondriën in de knop beter beschermd zijn tegen oxidatieve stress. Ze leveren ook documentatie dat mtHyPer7 een kwantitatieve uitlezing kan geven voor mitochondriaal H 2O2 met cellulaire en subcellulaire resolutie in ontluikende gist. Figuur 8: Het mitochondrialeH2O2-niveau is lager in de dochtercel. (A) Maximale projectie van een ratiometrisch beeld van mtHyPer7 in een representatieve cel. Pseudocolor geeft de verhouding geoxideerd:gereduceerd mtHyPer7 aan (schaal onderaan). Subcellulaire verschillen in de verhouding zijn duidelijk (pijlpunten). Schaalbalk = 1 μm. Celomtrek: wit. (B) Verschil tussen de mtHyPer7-verhouding in de knop en de moedercel. Voor elke individuele cel werd de waarde van de moederverhouding afgetrokken van de waarde van de knopverhouding en uitgezet als een punt. n = 193 cellen samengevoegd uit vijf onafhankelijke experimenten, weergegeven met verschillend gekleurde symbolen voor elk experiment. Gemiddelde ± SEM van het verschil tussen de mtHyPer7-verhouding in de knop en de moedercellen: -0,04297 ± 0,01266. p = 0,0008 ( gepaarde t-toets) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullende tabel S1: Stammen die in dit onderzoek zijn gebruikt. Lijst van gebruikte giststammen. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende tabel S2: Plasmiden gebruikt in dit onderzoek. Lijst van gebruikte plasmiden. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende tabel S3: Primers gebruikt in dit onderzoek. Lijst van gebruikte primers. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend dossier 1: Protocol voor de bouw van biosensorplasmide. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 2: Scripts voor geautomatiseerde analyse. Voor elk script worden voorbeeldinvoer- en uitvoerbestanden geleverd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

In dit protocol wordt een methode beschreven voor het gebruik van mtHyPer7 als biosensor om mitochondriale H 2 O₂in levende ontluikende gistcellen te beoordelen. De biosensor wordt geconstrueerd met behulp van een op CRISPR gebaseerde methode en geïntroduceerd in een geconserveerd genvrij gebied in het gistgenoom zonder het gebruik van selecteerbare markers. Vergeleken met door plasmiden overgedragen biosensoren, worden geïntegreerde biosensoren in alle cellen en op consistente niveaus tot expressie gebracht, wat betrouwbaardere kwantificeringsresultaten oplevert. Er worden geen selecteerbare markers gebruikt om mtHyPer7-expressieve cellen te genereren, wat het gebruik van een breder scala aan stamachtergronden mogelijk maakt en de genetische modificatie van cellen met biosensorexpressie vergemakkelijkt. Het mtHyPer7-eiwit is correct gericht op mitochondriën zonder merkbare effecten op de mitochondriale morfologie, functie, distributie of cellulaire groeisnelheid. mtHyPer7 vertoont een dosisafhankelijke respons op extern toegevoegde H 2 O₂. Bovendien is mtHyPer7 in staat om te rapporteren over de heterogeniteit van mitochondriale kwaliteit met subcellulaire resolutie. Ten slotte veroorzaakt het gebruik van een confocale microscoop met draaiende schijf in tegenstelling tot breedveldmicroscopie voor het afbeelden van mitochondriale biosensoren minder fotobleken tot fluoroforen en genereert het beelden met een hoge resolutie voor het analyseren van subcellulaire verschillen.

Beperkingen en alternatieve benaderingen
Deze methode is niet geschikt om cellen langer dan 10 minuten af te beelden, omdat de cellen onder het dekglaasje uitdrogen. Voor beeldvorming op langere termijn is het beter om de agarpadmethode⁴⁶ te gebruiken of om cellen te immobiliseren in een kweekschaal met glazen bodem gevuld met SC-medium.

Bij de keuze van de biosensor moet rekening worden gehouden met de concentratie van het doelwit onder experimentele omstandigheden. Als de gevoeligheid van HyPer7 te hoog is, is een andere HyPer-versie aan te bevelen, zoals HyPer3 of HyPerRed^47,48. Er moet echter worden opgemerkt dat andere HyPer-sondes pH-gevoeliger zijn. Voor een hogere gevoeligheid kan de op peroxiredoxine gebaseerde roGFP geschikter zijn (roGFP2Tsa2ΔCR)²⁷.

De stabiele oxidatietoestand van de H2_O2-sensoris gekoppeld aan zowel oxidatie- als reductiesnelheden. De oxidatiesnelheid van biosensoren wordt voornamelijk veroorzaakt door H 2 O₂, maar de reductiesnelheid hangt af van de antioxidantreductiesystemen die actief zijn in de cel en het organel. Het is aangetoond dat HyPer7 voornamelijk wordt gereduceerd door het thioredoxinesysteem in gistcytosol, en dat de reductie ervan sneller is dan die van roGFP2Tsa2ΔCR²⁷. Daarom moet bij het interpreteren van metingen van_H2O 2-biosensoren rekening worden gehouden met de verschillende reductiemechanismen en responsdynamiek van de sonde. In het bijzonder moet worden aangenomen dat het reductiesysteem tijdens het experiment een constante capaciteit handhaaft om_H2O_2-niveausaf te leiden uit de uitlezing van de biosensor. Als alternatief voor de hier beschreven scripts is een verscheidenheid aan andere software vrij beschikbaar gesteld voor de analyse van redoxsensoren⁴⁹.

Kritische stappen
Bij elke biosensor is het van cruciaal belang om aan te tonen dat de biosensor zelf geen invloed heeft op het proces dat wordt gemeten. Daarom is het belangrijk om de groei en mitochondriale morfologie van stammen onder elke experimentele omstandigheid te vergelijken. Hier wordt de mitochondriale morfologie beoordeeld met behulp van MitoTracker Red, dat mitochondriën kleurt op een membraanpotentiaalafhankelijke manier. Vergelijking van de mitochondriën in niet-getransformeerde en biosensor-getransformeerde cellen kan echter worden bereikt door kleuring met tetramethylrhodaminemethylester (TMRM), een alternatieve membraanpotentiaalgevoelige mitochondriale vitale kleurstof, of MitoTracker Green, die mitochondriën kleurt onafhankelijk van membraanpotentiaal. Als schadelijke effecten worden vermoed, kan het helpen om het expressieniveau te verlagen of de integratieplaats te wijzigen.

Het valideren van het dosis-responsgedrag van de sonde en de signaal-ruisverhouding van de beeldvormingstechniek zijn ook essentieel voor het verzamelen van robuuste resultaten. Als de variabiliteit binnen een groep groter is dan de variabiliteit tussen groepen, worden verschillen moeilijk te detecteren. Variabiliteit binnen de groep kan het gevolg zijn van echte populatievariatie of van ruis in het detectieproces. De belangrijkste stappen om de signaal:ruisverhouding te verhogen zijn beeldacquisitie (pixelwaardebereik en ruis), achtergrondaftrekking en drempelwaarden.

Geluidseffecten kunnen ook worden verminderd tijdens de berekeningsstappen. De meest eenvoudige benadering is het berekenen van de gewogen gemiddelde intensiteit op basis van de verhoudingsbeeldmetingen (Resultaten.csv), waarbij elke pixel de lokale verhouding tussen de excitatie-efficiëntie vertegenwoordigt. Dit levert een “pixelgewijze” verhouding op. Als de beeldsignaal:ruisverhouding echter laag is, kunnen robuustere resultaten worden verkregen door de gewogen gemiddelde intensiteit voor een ROI in zowel de teller- als de noemerkanalen te berekenen en vervolgens de verhouding tussen deze twee gewogen gemiddelden te berekenen (“regiogewijze” verhouding).

Als u een drempelmethode wilt selecteren, wordt de Fiji-opdracht Image | Aanpassen | Auto Threshold kan worden gebruikt om automatisch alle ingebouwde Fiji-methoden uit te proberen. Om segmentatie (drempelwaarden) te evalueren, wordt een opgeslagen masker omgezet in een selectie door te klikken op Bewerken | Selectie | Selectie maken, toegevoegd aan de ROI Manager (door op T te drukken) en vervolgens geactiveerd op het RAW-afbeeldingsbestand. Als mitochondriën niet adequaat worden gedetecteerd, moet een andere segmentatiemethode worden geprobeerd.

Bij het vergelijken van afbeeldingen is het essentieel om alle afbeeldingen met identieke beeldomstandigheden te verkrijgen en om alle afbeeldingen met identieke contrastverbetering weer te geven.

Bij het optimaliseren van de beeldvormingsomstandigheden moet rekening worden gehouden met mitochondriale beweging. Als de mitochondriën significant bewegen tussen excitatie bij 405 en 488 nm, zal het verhoudingsbeeld niet nauwkeurig zijn. Het wordt aanbevolen om de belichtingstijd <500 ms aan te houden en de excitatie te wijzigen met de snelst beschikbare methode (bijv. een triggerpuls of een akoestisch-optisch afstembaar filter). Bij het vastleggen van een Z-stapel moeten beide excitaties worden uitgevoerd voor elke Z-stap voordat naar de volgende Z-stap wordt gegaan.

Voor de weergave van de resultaten zijn veranderingen in tint (kleur) duidelijker voor het menselijk oog dan veranderingen in intensiteit. Daarom wordt de verhoudingswaarde geconverteerd naar een kleurenschaal voor eenvoudigere visuele interpretatie. Ingekleurde afbeeldingen kunnen ongemoduleerd zijn, waarbij alle mitochondriale pixels met dezelfde helderheid verschijnen, of intensiteitsgemoduleerd, waarbij de pixelintensiteit in de originele afbeelding wordt gebruikt om intensiteiten in de gekleurde afbeelding in te stellen.

Wijziging en probleemoplossing
Als alternatief voor het bevestigen van de mitochondriale functie door provocatie met paraquat, kunnen cellen worden gerepliceerd of geïnoculeerd in fermenteerbare en niet-fermenteerbare koolstofbronnen.

Voor aftrekken op de achtergrond, aftrekken van rollende ballen (door te navigeren naar Verwerken | Achtergrond aftrekken…) kan ook worden gebruikt om niet-uniforme verlichting te verwijderen. Er moet voor worden gezorgd dat de aanwezigheid van cellen de achtergrond die wordt afgetrokken niet verandert (door de optie Achtergrond maken aan te vinken en het resultaat te bekijken).

Samenvattend biedt de mtHyPer7-sonde een consistente, minimaal invasieve methode om de morfologische en functionele status van gistmitochondriën in levende cellen te relateren, en maakt het de studie mogelijk van een belangrijke cellulaire stressor en signaalmolecuul in een genetisch handelbaar, gemakkelijk toegankelijk modelsysteem.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken Katherine Filpo Lopez voor deskundige technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH) (GM122589 en AG051047) aan LP.

Deze studies maakten gebruik van de confocale en gespecialiseerde microscopie Shared Resource van het Herbert Irving Comprehensive Cancer Center aan de Columbia University, gedeeltelijk gefinancierd door de NIH/NCI Cancer Center Support Grant P30CA013696.

Materials

100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens	Nikon	MRD01905
Adenine sulfate	Sigma-Aldrich	#A9126
Bacto Agar	BD Difco	#DF0145170
Bacto Peptone	BD Difco	#DF0118170
Bacto Tryptone	BD Difco	#DF211705
Bacto Yeast Extract	BD Difco	#DF0127179
BamHI	New England Biolabs	R0136S
BglII	New England Biolabs	R0144S
Carbenicilin	Sigma-Aldrich	C1389
Carl Zeiss Immersol Immersion Oil	Carl Zeiss	444960
Dextrose (D-(+)-Glucose)	Sigma-Aldrich	#G8270
E. cloni 10G chemical competent cell	Bioserch Technologies	60108
FIJI	NIH		Schindelin et al 2012
G418 (Geneticin)	Sigma-Aldrich	A1720
GFP emission filter	Chroma		525/50
Gibson assembly	New England Biolabs	E2611
Graphpad Prism 7	GraphPad		https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
H₂O₂ (stable)	Sigma-Aldrich	H1009
HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO	Pon Lab	JYE057/EP41	Liao et al 20201
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific	E24
KAPA HiFi PCR kit	Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA	KK1006
L-arginine hydrochloride	Sigma-Aldrich	#A8094
laser	Agilent		405 and 488 nm
L-histidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	#H5659
L-leucine	Sigma-Aldrich	#L8912
L-lysine hydrochloride	Sigma-Aldrich	#L8662
L-methionine	Sigma-Aldrich	#M9625
L-phenylalanine	Sigma-Aldrich	#P5482
L-tryptophan	Sigma-Aldrich	#T8941
L-tyrosine	Sigma-Aldrich	#T8566
mHyPer7 plasmid	This study	JYE116
Microscope coverslips	ThermoScientific	3406	#1.5 (170 µm thickness)
Microscope slides	ThermoScientific	3050
MitoTracker Red CM-H2Xros	ThermoFisherScientific	M7513
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NEBuilder HiFi Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2621
Nikon Elements	Nikon		Microscope acquisition software
Nikon Ti Eclipse inverted microscope	Nikon
Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate)	Sigma-Aldrich	Cat. #856177
RStudio	Posit.co	Free desktop version
Spectrophotometer	Beckman	BU530
Stagetop incubator	Tokai Hit	INU
Uracil	Sigma-Aldrich	#U1128
Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids	BD Difco	#DF0919073
YN2_1_LT58_X2site	Addgene	177705	Pianale et al 2021
Zyla 4.2 sCMOS camera	Andor

References

vander Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).
McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: more than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
Shi, R., Hou, W., Wang, Z. -. Q., Xu, X. Biogenesis of iron-sulfur clusters and their role in DNA metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 735678 (2021).
McFaline-Figueroa, J. R., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).
Higuchi-Sanabria, R., et al. Mitochondrial anchorage and fusion contribute to mitochondrial inheritance and quality control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 27 (5), 776-787 (2016).
Higuchi-Sanabria, R., et al. Role of asymmetric cell division in lifespan control in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 14 (8), 1133-1146 (2014).
Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells. Free Radical Biology & Medicine. 50 (8), 963-970 (2011).
Laun, P., et al. Aged mother cells of Saccharomyces cerevisiae show markers of oxidative stress and apoptosis. Molecular Microbiology. 39 (5), 1166-1173 (2001).
Doudican, N. A., Song, B., Shadel, G. S., Doetsch, P. W. Oxidative DNA damage causes mitochondrial genomic instability in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 25 (12), 5196-5204 (2005).
Roca-Portoles, A., Tait, S. W. G. Mitochondrial quality control: from molecule to organelle. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3853-3866 (2021).
Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative stress. Annual Review of Biochemistry. 86, 715-748 (2017).
Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
Imlay, J. A., Fridovich, I. Assay of metabolic superoxide production in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (11), 6957-6965 (1991).
Fridovich, I. Mitochondria: are they the seat of senescence. Aging Cell. 3 (1), 13-16 (2004).
Quinlan, C. L., Perevoshchikova, I. V., Hey-Mogensen, M., Orr, A. L., Brand, M. D. Sites of reactive oxygen species generation by mitochondria oxidizing different substrates. Redox Biology. 1 (1), 304-312 (2013).
Griendling, K. K., Minieri, C. A., Ollerenshaw, J. D., Alexander, R. W. Angiotensin II stimulates NADH and NADPH oxidase activity in cultured vascular smooth muscle cells. Circulation Research. 74 (6), 1141-1148 (1994).
Griendling, K. K., Sorescu, D., Ushio-Fukai, M. NAD(P)H oxidase: role in cardiovascular biology and disease. Circulation Research. 86 (5), 494-501 (2000).
Edmondson, D. E., Binda, C., Wang, J., Upadhyay, A. K., Mattevi, A. Molecular and mechanistic properties of the membrane-bound mitochondrial monoamine oxidases. Biochemistry. 48 (20), 4220-4230 (2009).
Ramsay, R. R., Singer, T. P. The kinetic mechanisms of monoamine oxidases A and B. Biochemical Society Transactions. 19 (1), 219-223 (1991).
Ramsay, R. R. Kinetic mechanism of monoamine oxidase A. Biochemistry. 30 (18), 4624-4629 (1991).
Handy, D. E., Loscalzo, J. Redox regulation of mitochondrial function. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (11), 1323-1367 (2012).
Wood, Z. A., Schröder, E., Robin Harris, J., Poole, L. B. Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins. Trends in Biochemical Sciences. 28 (1), 32-40 (2003).
Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
Topell, S., Hennecke, J., Glockshuber, R. Circularly permuted variants of the green fluorescent protein. FEBS Letters. 457 (2), 283-289 (1999).
Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Methods. 3 (4), 281-286 (2006).
Kritsiligkou, P., Shen, T. K., Dick, T. P. A comparison of Prx- and OxyR-based H2O2 probes expressed in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100866 (2021).
Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11241-11246 (1999).
Abedi, M. R., Caponigro, G., Kamb, A. Green fluorescent protein as a scaffold for intracellular presentation of peptides. Nucleic Acids Research. 26 (2), 623-630 (1998).
Onukwufor, J. O., et al. A reversible mitochondrial complex I thiol switch mediates hypoxic avoidance behavior in C. elegans. Nature Communications. 13 (1), 2403 (2022).
Vega, M., et al. Antagonistic effects of mitochondrial matrix and intermembrane space proteases on yeast aging. BMC Biology. 20 (1), 160 (2022).
Torello Pianale, L., Rugbjerg, P., Olsson, L. Real-time monitoring of the yeast intracellular state during bioprocesses with a toolbox of biosensors. Frontiers in Microbiology. 12, 802169 (2022).
Imani, M., Mohajeri, N., Rastegar, M., Zarghami, N. Recent advances in FRET-based biosensors for biomedical applications. Analytical Biochemistry. 630, 114323 (2021).
Zadran, S., et al. Fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensors: visualizing cellular dynamics and bioenergetics. Applied Microbiology and Biotechnology. 96 (4), 895-902 (2012).
Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
Liao, P. -. C., Wolken, D. M. A., Serrano, E., Srivastava, P., Pon, L. A. Mitochondria-associated degradation pathway (MAD) function beyond the outer membrane. Cell Reports. 32 (2), 107902 (2020).
Higuchi-Sanabria, R., Swayne, T. C., Boldogh, I. R., Pon, L. A. Live-cell imaging of mitochondria and the actin cytoskeleton in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1365, 25-62 (2016).
Liao, P. -. C., Yang, E. J., Pon, L. A. Live-cell imaging of mitochondrial redox state in yeast cells. STAR Protocols. 1 (3), 100160 (2020).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
Chazotte, B. Labeling mitochondria with MitoTracker dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 990-992 (2011).
Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, T. Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis. Science. 299 (5613), 1751-1753 (2003).
Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nyström, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants can be suppressed by overproducing the protein aggregation-remodeling factor Hsp104p. Genes & Development. 21 (19), 2410-2421 (2007).
Erjavec, N., Cvijovic, M., Klipp, E., Nyström, T. Selective benefits of damage partitioning in unicellular systems and its effects on aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (48), 18764-18769 (2008).
Erjavec, N., Nyström, T. Sir2p-dependent protein segregation gives rise to a superior reactive oxygen species management in the progeny of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (26), 10877-10881 (2007).
Davidson, R., Liu, Y., Gerien, K. S., Wu, J. Q. Real-time visualization and quantification of contractile ring proteins in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1369, 9-23 (2016).
Bilan, D. S., et al. HyPer-3: a genetically encoded H2O2 probe with improved performance for ratiometric and fluorescence lifetime imaging. ACS Chemical Biology. 8 (3), 535-542 (2013).
Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5 (1), 5222 (2014).
Fricker, M. D. Quantitative redox imaging software. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 752-762 (2016).
Yang, E. J., Pernice, W. M., Pon, L. A. A role for cell polarity in lifespan and mitochondrial quality control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. iSCIENCE. 25 (3), 103957 (2022).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Yang, E. J., Boldogh, I. R., Ji, H., Pon, L., Swayne, T. C. Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells. J. Vis. Exp. (196), e65428, doi:10.3791/65428 (2023).

Automatically Generated