Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Otoantijenlerin İmmünojenitesinin Arttırılmasında Mycobacterium Paratuberculosis'in Adjuvan Aktivitesi
Summary
Burada, C57BL/6 farelerde deneysel otoimmün ensefalomiyeliti aktif olarak indüklemek için alternatif bir protokol sunuyoruz, ısıyla öldürülen Mycobacterium avium alt türü paratüberkülozu içeren tamamlanmamış Freund adjuvanında asılı duran immünojenik epitop miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG)35-55’i kullanıyoruz.
Abstract
Miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) tarafından indüklenen deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), inaktive Mycobacterium tuberculosis içeren tam Freund adjuvanında (CFA) emülsifiye edilmiş bir MOG peptid ile bağışıklamayı gerektirir. Mikobakterinin antijenik bileşenleri, T hücrelerini ücretli benzeri reseptörler yoluyla Th1 yanıtını teşvik eden sitokinler üretmeye teşvik etmek için uyarmak için dendritik hücreleri aktive eder. Bu nedenle, antijenik mücadele sırasında mevcut olan mikobakterilerin miktarı ve türleri, EAE’nin gelişimi ile doğrudan ilişkilidir. Bu yöntem makalesi, C57BL/6 farelerde EAE’yi, ısıyla öldürülen Mycobacterium avium alt türleri paratuberculosis suşu K-10’u içeren modifiye edilmiş tamamlanmamış bir Freund adjuvanını kullanarak indüklemek için alternatif bir protokol sunmaktadır.
Mycobacterium avium kompleksinin bir üyesi olan M. paratuberculosis, ruminantlarda Johne hastalığının etken maddesidir ve multipl skleroz da dahil olmak üzere çeşitli insan T hücresi aracılı bozukluklar için bir risk faktörü olarak tanımlanmıştır. Genel olarak, Mycobacterium paratuberculosis ile aşılanan fareler, aynı dozlarda 4 mg / mL’lik M. tuberculosis H37Ra suşunu içeren CFA ile aşılanmış farelerden daha erken başlangıçlı ve daha büyük hastalık şiddeti göstermiştir. Mycobacterium avium alt türleri paratuberculosis (MAP) suşu K-10’un antijenik belirleyicileri, efektör faz sırasında, anlamlı derecede daha yüksek sayıda T-lenfosit (CD4 + CD27 +), dendritik hücreler (CD11c + I-A / I-E +) ve monositler (CD11b + CD115 + ile karakterize edilen) güçlü bir Th1 hücresel yanıtını indükleyebilmiştir) dalakta CFA ile aşılanmış farelere kıyasla. Ayrıca, MOG peptidine proliferatif T hücresi yanıtı, M. paratuberculosis ile bağışıklanmış farelerde en yüksek olduğu görülmüştür. Formülasyonda M. paratuberculosis içeren bir adjuvanda emülsifiye edilmiş bir ensefalitojenin (örneğin, MOG35-55) kullanılması, EAE’nin indüksiyon fazı sırasında miyelin epitopuna özgü CD4 + T hücrelerini hazırlamak için dendritik hücreleri aktive etmek için alternatif ve doğrulanmış bir yöntem olabilir.
Introduction
Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), insan demiyelinizan bozukluklarının incelenmesi için yaygın bir modeldir1. EAE’nin birkaç modeli vardır: güçlü adjuvanlarla kombinasyon halinde farklı miyelin peptitleri kullanılarak aktif immünizasyon, miyeline özgü CD4 + lenfositlerin in vitro transferi ile pasif immünizasyon ve spontan EAE2’nin transgenik modelleri. Bu modellerin her biri, EAE’nin başlangıç, efektör fazı veya kronik faz gibi farklı yönlerinin incelenmesine izin veren belirli özelliklere sahiptir. EAE’nin miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) modeli, mononükleer inflamatuar infiltrasyon, periferik beyaz cevherde demiyelinizasyon vehastalık zirvesinden sonra iyileşmenin azalması ile karakterize olduğu için kronik nöroinflamasyon ve demiyelinasyonun immün aracılı mekanizmalarını incelemek için iyi bir modeldir.
MOG-EAE, duyarlı farelerin tam Freund adjuvanında (CFA) MOG35-55 peptidi ile bağışıklanması ve ardından boğmaca toksininin intraperitoneal enjeksiyonu ile indüklenir. Bu, kan-beyin bariyerinin geçirgenliğini arttırır ve çevrede aktive olan miyeline özgü T hücrelerinin, yeniden aktive edilecekleri merkezi sinir sistemine (CNS) ulaşmasını sağlar3. CFA, antijen sunan hücreler tarafından antijen alımını ve humoral ve hücre aracılı yanıtlarla ilişkili sitokinlerin ekspresyonunu artırarak EAE’nin indüksiyonunda anahtar rol oynar4. Bu mekanizma esas olarak, bileşenleri bağışıklık sistemi için güçlü bir uyaran sağlayan yağda emülsifiye edilmiş öldürülmüş Mycobacterium tuberculosis’in varlığından kaynaklanmaktadır5. Aslında, EAE’nin indüksiyonu, antijenik meydan okuma6 sırasında mevcut olan mikobakteri miktarı ile doğrudan ilişkilidir.
Freund’un tamamlanmamış adjuvan7’sine Mycobacterium butyricum gibi diğer öldürülmüş mikobakterilerin eklenmesi ve adjuvan kombinasyonlarınınetkisi 8, EAE’nin klinik seyrini modüle edebilir ve sonuç olarak sonuçların tekrarlanabilirliğini etkileyebilir. Ruminantlarda Johne hastalığının etiyolojik ajanı olan Mycobacterium avium alt türleri paratuberculosis (MAP), antijenik bileşenleri multipl skleroz ve nöromiyelit optika spektrum bozukluğu 9 olan hastalarda güçlü bir humoral ve hücre aracılı yanıt ortaya çıkarabildiğinden, insan CNS9’un enflamatuar bozuklukları ile ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, bu protokolde, CFA’daki M. tuberculosis’i M. paratuberculosis ile değiştirerek MOG-EAE’yi indüklemek için alternatif ve tekrarlanabilir bir yöntem göstermekteyiz.
Protocol
Representative Results
Discussion
M. paratuberculosis10 içeren bir adjuvanda emülsifiye edilmiş MOG35-55 peptidi kullanarak C57BL / 6J farelerde şiddetli EAE’yi aktif olarak indüklemek için sağlam bir alternatif protokol gösterdik. EAE’nin bu yöntemle indüklenmesi, CFA ile ortak protokolün neden olduğundan daha ciddi bir hastalığa neden oldu. Bu fark, mikobakterilerin hücre duvarındaki farklı lipid bileşenlerinden kaynaklanıyor olabilir11. Aslında, diğer mikobakteril…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Japon Bilimin Teşviki Derneği’nden bir hibeden destek aldı (hibe no. JP 23K14675).
Materials
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O’Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
- Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G. Mechanisms of action of adjuvants. Frontiers in Immunology. 4, 114 (2013).
- Kubota, M., et al. Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids. Heliyon. 6 (5), e04064 (2020).
- Nicolo, C., et al. Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a "core" repertoire of specific T cells. International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).
- O’Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).
- Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines. Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis. Frontiers in Neurology. 8, 216 (2017).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).
- Biet, F., et al. Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium. Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Scientific Reports. 7 (1), 3179 (2017).
- Cossu, D., et al. A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE. Journal of Neuroimmunology. 352, 577477 (2021).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models. Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).
