実験的自己免疫性脳脊髄炎における自己抗原の免疫原性増強における 抗酸菌パラ結核の アジュバント活性
Summary
ここでは、加熱死菌菌アビウム亜種パラ結核を含む不完全フロイントアジュバントに懸濁した免疫原性エピトープミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)35-55を使用して、C57BL/6マウスで実験的自己免疫性脳脊髄炎を積極的に誘導するための代替プロトコルを提示します。
Abstract
ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質(MOG)によって誘発される実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、不活化 結核菌を含む完全フロイントアジュバント(CFA)で乳化したMOGペプチドによる免疫を必要とします。マイコバクテリウムの抗原成分は樹状細胞を活性化してT細胞を刺激し、トール様受容体 を介して Th1応答を促進するサイトカインを産生します。したがって、抗原チャレンジ中に存在するマイコバクテリアの量と種は、EAEの発生に直接関係しています。このメソッド論文は、加熱死菌ア ビウム 亜種 パラ結核 株K-10を含む改変不完全フロイントアジュバントを使用してC57BL/6マウスにEAEを誘導するための代替プロトコルを提示します。
マイコバクテリウム・アビウム複合体のメンバーであるM.パラ結核は、反芻動物のヨーネ病の原因物質であり、多発性硬化症を含むいくつかのヒトT細胞媒介性疾患の危険因子として同定されています。全体として、抗酸菌パラ結核を免疫したマウスは、結核菌H37Ra株を含むCFAを同じ用量の4 mg / mLで免疫したマウスよりも発症が早く、疾患の重症度が高かった。マイコバクテリウム・アビウム亜種パラ結核(MAP)株K-10の抗原決定基は、Tリンパ球(CD4+ CD27+)、樹状細胞(CD11c+ I-A/I-E+)、および単球(CD11b+ CD115+)の数が有意に多いことを特徴とする、エフェクター期に強力なTh1細胞応答を誘導することができました)CFAで免疫したマウスと比較した脾臓における。さらに、MOGペプチドに対する増殖性T細胞応答は、M.パラ結核免疫マウスで最も高かったようです。製剤中のパラ結核菌を含むアジュバント中で乳化された脳炎原(例えば、MOG35-55)の使用は、EAEの誘導段階でミエリンエピトープ特異的CD4+ T細胞をプライミングするための樹状細胞を活性化するための代替的かつ検証された方法であり得る。
Introduction
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、ヒト脱髄障害の研究のための一般的なモデルです1。EAEにはいくつかのモデルがある:強力なアジュバントと組み合わせた異なるミエリンペプチドを用いた能動免疫、ミエリン特異的CD4+リンパ球のin vitro導入による受動免疫、および自発的EAE2のトランスジェニックモデル。これらの各モデルには、発症期、エフェクター期、慢性期など、EAEのさまざまな側面を研究できる特定の機能があります。EAEのミエリン希突起膠細胞糖タンパク質(MOG)モデルは、単核炎症浸潤、末梢白質における脱髄、および疾患ピーク1後の回復の低下を特徴とするため、慢性神経炎症および脱髄の免疫媒介メカニズムを研究するための優れたモデルです。
MOG-EAEは、完全フロイントアジュバント(CFA)中のペプチドMOG35-55 で感受性マウスを免疫し、続いて百日咳毒素を腹腔内注射することによって誘導されます。これにより、血液脳関門の透過性が高まり、末梢で活性化されたミエリン特異的T細胞が中枢神経系(CNS)に到達し、そこで再活性化されます3。CFAは、抗原提示細胞による抗原の取り込みと、体液性および細胞を介した応答に関連するサイトカインの発現を増強することにより、EAEの誘導に重要な役割を果たします4。このメカニズムは、主に油中に乳化された 結核 菌の死滅の存在によるものであり、その成分は免疫系に強い刺激を与える5。実際、EAEの誘導は、抗原チャレンジ6中に存在するマイコバクテリウムの量に直接関係しています。
不完全なフロイントアジュバント7へのマイコバクテリウム・ブチリカムなどの他の死滅抗酸菌の添加、およびアジュバントの組み合わせ8の効果は、EAEの臨床経過を調節し、その結果、結果の再現性に影響を与える可能性があります。反芻動物のヨーネ病の病因物質であるマイコバクテリウム・アビウム亜種パラ結核(MAP)は、その抗原成分が多発性硬化症および視神経脊髄炎スペクトラム障害の患者において強力な体液性および細胞性応答を誘発することができるため、ヒトCNS9の炎症性疾患と関連している9。したがって、このプロトコルでは、CFAの結核菌をパラ結核菌に置き換えることにより、MOG-EAEを誘導するための代替的で再現性のある方法を示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
パラ結核菌10を含むアジュバントで乳化したペプチドMOG35-55を使用して、C57BL / 6Jマウスで重度のEAEを積極的に誘導するための堅牢な代替プロトコルを実証しました。この方法によるEAEの誘導は、CFAとの共通プロトコールによって誘発されたものよりも重篤な疾患をもたらした。この違いは、抗酸菌11の細胞壁における脂質成分の違いに起因す?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、日本学術振興会の助成を受けています(助成番号。特開23K14675)。
Materials
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
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