Adjuvante Aktivität von Mycobacterium paratuberculosis bei der Verbesserung der Immunogenität von Autoantigenen während der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis
Summary
In dieser Arbeit stellen wir ein alternatives Protokoll vor, um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in C57BL/6-Mäusen aktiv zu induzieren, indem wir das immunogene Epitop Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)35-55 verwenden, das in einem unvollständigen Freund-Adjuvans suspendiert ist, das die hitzeabgetötete Mycobacterium avium-Subspezies paratuberculosis enthält.
Abstract
Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE), die durch Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) induziert wird, erfordert eine Immunisierung durch ein MOG-Peptid, das in vollständigem Freund-Adjuvans (CFA) mit inaktiviertem Mycobacterium tuberculosis emulgiert ist. Die antigenen Bestandteile des Mykobakteriums aktivieren dendritische Zellen, um T-Zellen zur Produktion von Zytokinen anzuregen, die die Th1-Antwort über Toll-like-Rezeptoren fördern. Daher stehen die Menge und Art der Mykobakterien, die während der antigenen Herausforderung vorhanden sind, in direktem Zusammenhang mit der Entwicklung von EAE. In dieser Arbeit wird ein alternatives Protokoll zur Induktion von EAE in C57BL/6-Mäusen unter Verwendung eines modifizierten unvollständigen Freund-Adjuvans vorgestellt, das den hitzeabgetöteten Mycobacterium avium-Subspezies Paratuberculosis-Stamm K-10 enthält.
M. paratuberculosis, ein Mitglied des Mycobacterium avium-Komplexes, ist der Erreger der Johne-Krankheit bei Wiederkäuern und wurde als Risikofaktor für mehrere menschliche T-Zell-vermittelte Erkrankungen, einschließlich Multipler Sklerose, identifiziert. Insgesamt zeigten Mäuse, die mit Mycobacterium paratuberculosis immunisiert wurden, einen früheren Krankheitsbeginn und einen höheren Schweregrad der Erkrankung als Mäuse, die mit CFA immunisiert wurden, die den Stamm von M. tuberculosis H37Ra in der gleichen Dosis von 4 mg/ml enthielt. Die antigenen Determinanten des Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) Stammes K-10 waren in der Lage, während der Effektorphase eine starke Th1-Zellantwort zu induzieren, die durch eine signifikant höhere Anzahl von T-Lymphozyten (CD4+, CD27+), dendritischen Zellen (CD11c+, I-A/I-E+) und Monozyten (CD11b+, CD115+) gekennzeichnet war) in der Milz im Vergleich zu Mäusen, die mit CFA immunisiert wurden. Darüber hinaus schien die proliferative T-Zell-Antwort auf das MOG-Peptid in M. paratuberculosis-immunisierten Mäusen am höchsten zu sein. Die Verwendung eines Enzephalitogens (z. B. MOG35-55), das in einem Adjuvans emulgiert ist, das M. paratuberculosis in der Formulierung enthält, kann eine alternative und validierte Methode sein, um dendritische Zellen für das Priming von Myelinepitop-spezifischen CD4+ T-Zellen während der Induktionsphase von EAE zu aktivieren.
Introduction
Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein gängiges Modell für die Untersuchung menschlicher demyelinisierender Erkrankungen1. Es gibt verschiedene Modelle der EAE: die aktive Immunisierung mit verschiedenen Myelinpeptiden in Kombination mit potenten Adjuvantien, die passive Immunisierung durch In-vitro-Transfer von myelinspezifischen CD4+ -Lymphozyten und transgene Modelle der spontanen EAE2. Jedes dieser Modelle verfügt über spezifische Merkmale, die es ermöglichen, verschiedene Aspekte der EAE zu untersuchen, wie z. B. den Beginn, die Effektorphase oder die chronische Phase. Das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-Modell (MOG) der EAE ist ein gutes Modell, um die immunvermittelten Mechanismen der chronischen Neuroinflammation und Demyelinisierung zu untersuchen, da es durch mononukleäre entzündliche Infiltration, Demyelinisierung in der peripheren weißen Substanz und reduzierte Erholung nach dem Krankheitshöhepunktgekennzeichnet ist 1.
MOG-EAE wird durch Immunisierung empfänglicher Mäuse mit dem Peptid MOG35-55 im vollständigen Freund’schen Adjuvans (CFA) induziert, gefolgt von einer intraperitonealen Injektion von Pertussis-Toxin. Dadurch erhöht sich die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke und Myelin-spezifische T-Zellen, die in der Peripherie aktiviert werden, gelangen ins zentrale Nervensystem (ZNS), wo sie reaktiviert werden3. CFA spielt eine Schlüsselrolle bei der Induktion von EAE, indem es die Antigenaufnahme durch antigenpräsentierende Zellen und die Expression von Zytokinen im Zusammenhang mit humoralen und zellvermittelten Reaktionen erhöht4. Dieser Mechanismus ist hauptsächlich auf das Vorhandensein von abgetötetem Mycobacterium tuberculosis zurückzuführen, das in Öl emulgiert ist und dessen Bestandteile einen starken Reiz für das Immunsystem darstellen5. Tatsächlich steht die Induktion von EAE in direktem Zusammenhang mit der Menge an Mykobakterien, die während der Antigen-Provokation vorhanden ist6.
Die Zugabe anderer abgetöteter Mykobakterien, wie z.B. Mycobacterium butyricum, zu unvollständigem Freund-Adjuvans7 sowie die Wirkung von Adjuvanskombinationen8 können den klinischen Verlauf der EAE modulieren und somit die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse beeinflussen. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), der ätiologische Erreger der Johne-Krankheit bei Wiederkäuern, wurde mit entzündlichen Erkrankungen des menschlichen ZNS in Verbindung gebracht 9, da seine antigenen Komponenten in der Lage sind, bei Patienten mit Multipler Sklerose und Neuromyelitis-optica-Spektrum-Störungeine starke humorale und zellvermittelte Reaktion hervorzurufen9. Daher zeigen wir in diesem Protokoll eine alternative und reproduzierbare Methode zur Induktion von MOG-EAE, indem M. tuberculosis in CFA durch M. paratuberculosis ersetzt wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir demonstrierten ein robustes alternatives Protokoll zur aktiven Induktion schwerer EAE in C57BL/6J-Mäusen unter Verwendung des Peptids MOG35-55 , das in einem Adjuvans mit M. paratuberculosis10 emulgiert wurde. Die Induktion von EAE durch diese Methode führte zu einer schwereren Erkrankung als diejenige, die durch das gemeinsame Protokoll mit CFA induziert wurde. Dieser Unterschied könnte auf die unterschiedlichen Lipidkomponenten in der Zellwand der Mykobakterien zurück…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Japanischen Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft unterstützt (Förder-Nr. JP 23K14675).
Materials
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
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