Actividad adyuvante de Mycobacterium paratuberculosis en la mejora de la inmunogenicidad de los autoantígenos durante la encefalomielitis autoinmune experimental
Summary
Aquí, presentamos un protocolo alternativo para inducir activamente encefalomielitis autoinmune experimental en ratones C57BL / 6, utilizando la glicoproteína oligodendrocitos de mielina inmunogénica epítopo (MOG) 35-55 suspendida en el adyuvante de Freund incompleto que contiene la subespecie paratuberculosis Mycobacterium avium muerta por calor.
Abstract
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inducida por la glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG) requiere la inmunización por un péptido MOG emulsionado en el adyuvante de Freund completo (CFA) que contiene Mycobacterium tuberculosis inactivada. Los componentes antigénicos de la micobacteria activan las células dendríticas para estimular a las células T a producir citoquinas que promueven la respuesta Th1 a través de receptores tipo toll. Por lo tanto, la cantidad y las especies de micobacterias presentes durante el desafío antigénico están directamente relacionadas con el desarrollo de EAE. Este documento de métodos presenta un protocolo alternativo para inducir EAE en ratones C57BL / 6 utilizando un adyuvante de Freund incompleto modificado que contiene la subespecie de paratuberculosis K-10 de Mycobacterium avium muerta por calor.
M. paratuberculosis, un miembro del complejo Mycobacterium avium, es el agente causal de la enfermedad de Johne en rumiantes y se ha identificado como un factor de riesgo para varios trastornos mediados por células T humanas, incluida la esclerosis múltiple. En general, los ratones inmunizados con Mycobacterium paratuberculosis mostraron un inicio más temprano y una mayor gravedad de la enfermedad que los ratones inmunizados con CFA que contenían la cepa de M. tuberculosis H37Ra a las mismas dosis de 4 mg / ml. Los determinantes antigénicos de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) cepa K-10 fueron capaces de inducir una fuerte respuesta celular Th1 durante la fase efectora, caracterizada por un número significativamente mayor de linfocitos T (CD4+ CD27+), células dendríticas (CD11c+ I-A/I-E+) y monocitos (CD11b+ CD115+) en el bazo en comparación con los ratones inmunizados con CFA. Además, la respuesta proliferativa de las células T al péptido MOG pareció ser más alta en ratones inmunizados con M. paratuberculosis. El uso de un encefalitógeno (por ejemplo, MOG35-55) emulsionado en un adyuvante que contiene M. paratuberculosis en la formulación puede ser un método alternativo y validado para activar las células dendríticas para preparar las células T CD4+ específicas del epítopo de mielina durante la fase de inducción de la EAE.
Introduction
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo común para el estudio de los trastornos desmielinizantes humanos1. Existen varios modelos de EAE: inmunización activa utilizando diferentes péptidos de mielina en combinación con potentes adyuvantes, inmunización pasiva mediante transferencia in vitro de linfocitos CD4+ específicos de mielina y modelos transgénicos de EAE2 espontánea. Cada uno de estos modelos tiene características específicas que permiten estudiar diferentes aspectos de EAE, como el inicio, la fase efectora o la fase crónica. El modelo de glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG) de EAE es un buen modelo para estudiar los mecanismos inmunomediados de la neuroinflamación crónica y la desmielinización, ya que se caracteriza por la infiltración inflamatoria mononuclear, la desmielinización en la sustancia blanca periférica y la reducción de la recuperación después del pico de la enfermedad1.
MOG-EAE es inducida por inmunización de ratones susceptibles con el péptido MOG35-55 en adyuvante de Freund completo (CFA), seguido de una inyección intraperitoneal de toxina pertussis. Esto aumenta la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y permite que las células T específicas de mielina activadas en la periferia lleguen al sistema nervioso central (SNC), donde serán reactivadas3. La CFA juega un papel clave en la inducción de EAE al mejorar la captación de antígenos por las células presentadoras de antígenos y la expresión de citoquinas relacionadas con las respuestas humorales y mediadas por células4. Este mecanismo se debe principalmente a la presencia de Mycobacterium tuberculosis muerta emulsionada en aceite, cuyos componentes proporcionan un fuerte estímulo para el sistema inmune5. De hecho, la inducción de EAE está directamente relacionada con la cantidad de micobacterias presentes durante el desafío antigénico6.
La adición de otras micobacterias muertas, como Mycobacterium butyricum, al adyuvante incompleto de Freund 7, así como el efecto de combinaciones adyuvantes8, pueden modular el curso clínico de la EAE y, en consecuencia, influir en la reproducibilidadde los resultados. Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP), el agente etiológico de la enfermedad de Johne en rumiantes, se ha asociado con trastornos inflamatorios del SNChumano 9, ya que sus componentes antigénicos son capaces de provocar una fuerte respuesta humoral y mediada por células en pacientes con esclerosis múltiple y trastorno del espectro de neuromielitis óptica9. Por lo tanto, en este protocolo, mostramos un método alternativo y reproducible para inducir MOG-EAE mediante la sustitución de M. tuberculosis en CFA por M. paratuberculosis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Demostramos un protocolo alternativo robusto para inducir activamente EAE severa en ratones C57BL / 6J utilizando el péptido MOG35-55 emulsionado en un adyuvante que contiene M. paratuberculosis10. La inducción de EAE por este método resultó en una enfermedad más grave que la inducida por el protocolo común con CFA. Esta diferencia podría deberse a los diferentes componentes lipídicos en la pared celular de las micobacterias11. De hecho, a difere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo recibió apoyo de una subvención de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (subvención no. JP 23K14675).
Materials
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
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