在这里,我们提出了一种使用纳米孔技术表征狂犬病病毒(RABV)基因组的快速且具有成本效益的工作流程。该工作流程旨在支持地方层面的基因组学监测,提供有关循环RABV谱系及其在区域系统发育中的位置的信息,以指导狂犬病控制措施。
基因组数据可用于追踪传染病的传播和地理传播。然而,在许多低收入和中等收入国家,基因组监测所需的测序能力仍然有限,在这些国家,狗介导的狂犬病和/或由吸血蝙蝠等野生动物传播的狂犬病构成了重大的公共卫生和经济问题。我们在这里介绍一种使用纳米孔技术的快速且经济实惠的从样品到序列再到解释的工作流程。简要介绍了狂犬病的样本采集和诊断方案,然后详细介绍了优化的全基因组测序工作流程,包括多重聚合酶链反应 (PCR) 的引物设计和优化、改良的低成本测序文库制备、活体和离线碱基检出测序、遗传谱系指定和系统发育分析。演示了工作流程的实施,并强调了本地部署的关键步骤,例如管道验证、引物优化、纳入阴性对照,以及使用公开可用的数据和基因组工具(GLUE、MADDOG)在区域和全球系统发育中进行分类和定位。工作流程的周转时间为 2-3 天,成本从 96 次样品运行的每个样品 25 美元到 12 次样品运行的每个样品 80 美元不等。我们的结论是,在中低收入国家建立狂犬病病毒基因组监测是可行的,可以支持实现到2030年实现零狗介导的人类狂犬病死亡的全球目标,并加强对野生动物狂犬病传播的监测。此外,该平台可以适用于其他病原体,有助于建立多功能基因组能力,有助于流行病和大流行的准备。
狂犬病病毒 (RABV) 是弹状病毒科中的一种裂解 病毒, 可引起哺乳动物致命的神经系统疾病1。尽管狂犬病可以通过接种疫苗100%预防,但在狂犬病流行国家,狂犬病仍然是一个主要的公共卫生和经济问题。据估计,每年有60,000例人类狂犬病死亡,其中95%以上发生在非洲和亚洲,其中狗是主要宿主2。相比之下,狗的疫苗接种已经导致西欧、北美和拉丁美洲大部分地区消除了狗介导的狂犬病。在这些地区,狂犬病的宿主现在仅限于野生动物,如蝙蝠、浣熊、臭鼬和野生犬科动物3.在整个拉丁美洲,普通吸血蝙蝠是狂犬病的一个有问题的来源,因为在夜间喂血期间,蝙蝠经常溢出到人类和牲畜4.据估计,狂犬病每年对全球经济的影响为86亿美元,其中牲畜损失占6%5。
来自病毒病原体的序列数据与有关感染时间和来源的元数据相结合,可以提供可靠的流行病学见解6.对于RABV,测序已被用于调查疫情的起源7,8,确定宿主与野生动物或家犬的关联8,9,10,11,12,并追踪人类病例的来源13,14。使用系统发育分析进行的暴发调查表明,狂犬病是通过从加里曼丹或苏拉威西岛附近的流行地区15的单一传入而出现在印度尼西亚巴厘岛以前没有狂犬病的省份。与此同时,在菲律宾,朗布隆省塔布拉斯岛的疫情被证明是从吕宋岛16主岛引入的。病毒基因组数据还被用于更好地了解在地理上靶向控制措施所需的病原体传播动态。例如,RABV 的基因组特征说明了分支 17、18、19、谱系20、21、22、人类介导的病毒运动 17、23、24 和元种群动力学 25,26 的地理聚类。
疾病监测是基因组监测的一项重要功能,随着全球测序能力的提高,以应对SARS-CoV-2大流行,基因组监测得到了加强。基因组监测支持实时跟踪关注的SARS-COV-2变异株27,28和相关对策6。可及测序技术(如纳米孔技术)的进步导致了人类29、30、31、32 和动物33、34、35 病原体快速测序的改进和更实惠的方案。然而,在许多狂犬病流行国家,开展病原体基因组监测仍存在障碍,SARS-CoV-2测序能力的全球差异表明了这一点36。实验室基础设施、供应链和技术知识的局限性使得基因组监测的建立和常规化具有挑战性。在本文中,我们展示了如何在资源有限的环境中部署优化、快速且经济实惠的全基因组测序工作流程进行 RABV 监测。
Brunker 等人 61 利用 ARTIC 网络46 的资源开发了一种可访问的 RABV、基于纳米孔的全基因组测序工作流程。在这里,我们介绍了一个更新的工作流程,包括从样本到序列再到解释的完整步骤。该工作流程详细介绍了用于全基因组测序的脑组织样本的制备,提供了用于处理读取和生成共识序列的生物信息学管道,并重点介绍了两种狂犬病特异性工具,用于自动谱系分配和确定系统发育背景。更新后的工作流程还为设置适当的计算和实验室工作区提供了全面的说明,并考虑了在不同上下文(包括低资源设置)中实施的注意事项。我们已经证明,在四个没有或基因组监测能力有限的RABV流行中低收入国家的学术和研究机构环境中成功实施了该工作流程。事实证明,该工作流程能够适应各种设置的应用,并且具有不同专业知识的用户也可以理解。
这种用于 RABV 测序的工作流程是最全面的公开协议(涵盖从样本到测序再到解释的步骤),专门用于降低启动和运行成本。与其他平台(如Illumina61)相比,使用纳米孔技术进行文库制备和测序所需的时间和成本大大降低,并且持续的技术发展正在提高序列质量和准确性,使其与Illumina62相媲美。
该协议旨在在各种低资源环境中具有弹性。通过参考核心协议随附的故障排除和修改指南,支持用户根据自己的需求调整工作流程。在工作流程中增加用户友好的生物信息学工具是对原始协议的重大发展,它提供了快速和标准化的方法,可以由具有最少生物信息学经验的用户应用这些方法来解释本地环境中的序列数据。 就地 进行这项工作的能力往往受到需要具备特定编程和系统发育技能的限制,这需要密集和长期的技能培训投资。虽然这种技能对于彻底解释序列数据很重要,但基本和可访问的解释工具同样是可取的,以便能够培养当地的“测序冠军”,他们的核心专业知识可能是基于湿实验室的,使他们能够解释并拥有数据的所有权。
由于该方案已在多个国家实施多年,我们现在可以就如何优化多重引物方案以提高覆盖率和处理累积的多样性提供指导。还努力帮助用户提高成本效益或便于在特定地区进行采购,这通常是对分子方法可持续性的挑战63。例如,在非洲(坦桑尼亚、肯尼亚和尼日利亚),我们在接头连接步骤选择了钝/TA 连接酶预混液,这更容易从当地供应商处获得,并且是其他连接试剂的更便宜的替代品。
根据经验,有几种方法可以降低每个样品和每次运行的成本。减少每次运行的样品数量(例如,从 24 个样品减少到 12 个样品)可以延长流通池在多次运行中的使用寿命,而增加每次运行的样品数量可以最大限度地延长时间和试剂。在我们手中,我们每三次测序运行中就有一次能够清洗和重复使用流通池,从而能够对另外 55 个样品进行测序。使用后立即清洗流通池,或者如果不可能,则在每次运行后从废物通道中去除废液,似乎可以保留可用于第二次运行的孔隙数量。考虑到流通池中可用的初始孔数,还可以优化一次运行,以计划在特定流通池中运行多少样品。
尽管工作流程旨在尽可能全面,并添加了详细的指导和路标资源,但该过程仍然很复杂,对于新用户来说可能令人生畏。鼓励用户寻求面对面的培训和支持,最好是在当地,或者通过外部合作者。例如,在菲律宾,一个关于使用ONT进行SARS-CoV-2基因组监测的区域实验室能力建设项目已经培养了卫生保健诊断医生的核心能力,这些能力很容易转移到RABV测序中。如果没有动手培训,SPRI磁珠清理等重要步骤可能很难掌握,而无效的清理可能会损坏流通池并影响运行。在实验室中处理扩增子时,样品污染始终是一个主要问题,并且可能难以消除。特别是,在运行后的生物信息学中,样品之间的交叉污染极难检测。良好的实验室技术和实践,如保持清洁的工作表面、分离PCR前后区域以及纳入阴性对照,对于确保质量控制至关重要。纳米孔测序的快速发展是常规RABV基因组监测的优点和缺点。纳米孔的精度、可及性和协议库的不断改进拓宽并提高了其应用范围。然而,同样的发展使得维护标准操作程序和生物信息学管道具有挑战性。在该协议中,我们提供了一份文件,帮助从旧的纳米孔库制备试剂盒过渡到当前的纳米孔文库制备试剂盒(材料表)。
中低收入国家测序的一个常见障碍是可及性,不仅包括成本,还包括及时采购耗材(特别是测序试剂,对采购团队和供应商来说相对较新的测序试剂)和计算资源的能力,以及简单地获得稳定的电力和互联网。使用便携式纳米孔测序技术作为该工作流程的基础有助于解决许多这些可访问性问题,我们已经演示了在一系列环境中使用我们的方案,在国内进行完整的方案和分析。诚然,及时采购设备和测序耗材仍然是一个挑战,在许多情况下,我们被迫从英国携带或运送试剂。然而,在某些地区,我们能够完全依赖当地的试剂供应路线,这得益于对SARS-CoV-2测序的投资(例如菲律宾),这些投资简化了采购流程,并开始使病原体基因组学的应用正常化。
通过一次性安装,最大限度地减少了对稳定互联网连接的需求;例如,GitHub 存储库、软件下载和纳米孔测序本身只需要互联网访问即可开始运行(而不是整个运行),或者可以在公司同意的情况下完全离线执行。如果移动数据可用,则可以将手机用作笔记本电脑的热点,以开始测序运行,然后在运行期间断开连接。在常规处理样品时,数据存储需求可能会迅速增长,理想情况下,数据将存储在服务器上。否则,固态硬盘 (SSD) 硬盘的采购成本相对较低。
虽然我们认识到中低收入国家的基因组监测仍然存在障碍,但增加对建立基因组学可及性和专业知识的投资(例如,非洲病原体基因组学倡议[Africa PGI])64 表明这种情况将得到改善。基因组监测对于大流行防范至关重要6,可以通过对RABV等地方病原体进行基因组监测来建立能力。SARS-CoV-2大流行期间强调的全球测序能力差异应成为推动变革的驱动力,以解决这些结构性不平等问题。
这种从样本到序列再到解释的RABV工作流程,包括可访问的生物信息学工具,有可能用于指导控制措施,目标是到2030年实现狗介导的狂犬病导致人类零死亡的目标,并最终消除RABV变异株。结合相关元数据,该协议产生的基因组数据有助于在疫情调查期间快速鉴定RABV和鉴定一个国家或地区的流行谱系60,61,65。我们主要使用狗介导的狂犬病的例子来说明我们的管道;但是,该工作流程直接适用于野生动物狂犬病。这种可转移性和低成本最大限度地减少了常规测序的难题,不仅针对狂犬病,而且针对其他病原体46,66,67,以改善疾病管理和控制。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了惠康 [207569/Z/17/Z、224670/Z/21/Z]、医学研究委员会 [MR/R025649/1] 和菲律宾科学技术部 (DOST) 的牛顿资助、英国研究与创新全球 COVID-19 努力 [MR/V035444/1]、格拉斯哥大学机构战略支持基金 [204820]、医学研究委员会新研究者奖 (KB) [MR/X002047/1] 的支持, 国际伙伴关系发展基金、DOST 英国文化协会菲律宾学生奖学金 (CB)、国家卫生研究所 [17/63/82] GemVi 奖学金 (GJ) 以及格拉斯哥大学 MVLS DTP (KC) [125638-06]、EPSRC DTP (RD) [EP/T517896/1] 和 Wellcome IIB DTP (HF) [218518/Z/19/Z] 的学生奖学金。我们感谢支持这项工作的同事和合作者:Daniel Streicker、Alice Broos、Elizabeth Miranda、DVM、Daria Manalo、DVM、Thumbi Mwangi、Kennedy Lushasi、Charles Kayuki、Jude Karlo Bolivar、Jeromir Bondoc、Esteven Balbin、Ronnel Tongohan、Agatha Ukande、Davis Kuchaka、Mumbua Mutunga、Lwitiko Sikana 和 Anna Czupryna。
Brand name | |||
Software | |||
Sequencing software (MinKnow) |
Oxford Nanopore Technologies | https://community.nanoporetech.com/downloads | |
Bioinformatics tool kit (Guppy) |
Oxford Nanopore Technologies | https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018 | |
Equipment | |||
Thermal cycler (miniPCR™ mini16 thermal cycler) |
Cambio | MP-QP-1016-01 | |
Homogenizer (Precellys Evolution Touch Homogenizer) |
Bertin Instruments | EQ02520-300 | |
Cold Racks (0.2-0.5mL) (PCR Mini-cooler with transparent lid) |
BRAND | 781260 | |
Pipettor | |||
(Pipetman L Fixed F1000L, 1000 uL) | Gilson | SKU: FA10030 | |
(Pipetman L Fixed F100L, 100 uL) | Gilson | SKU: FA10024 | |
(Pipetman L Fixed F10L, 10 uL) | Gilson | SKU: FA10020 | |
(Pipetman L Fixed F1L, 1 uL) | Gilson | SKU: FA10025 | |
(Pipetman L Fixed F20L, 20 uL) | Gilson | SKU: FA10021 | |
(Pipetman L Fixed F250L, 250 uL) | Gilson | SKU: FA10026 | |
Fluorometer (Qubit 4 Fluorometer) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q33238 | |
Laptop (Any brand with ~2 GB of drive space, minimum of 512 GB storage space, msi installer [GPU]) |
|||
Microcentrifuge (Refrigerated centrifuge) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 75004081 | |
Vortex mixer (Basic vortex mixer) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 88882011 | |
Magnetic rack (DynaMag -2 Magnet) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 12321D | |
Sequencing device (MinION) |
Oxford Nanopore Technologies | MinION Mk1B | |
RNA Extraction | |||
RNA extraction kit (Qiagen RNEasy Mini Kit 250) |
Qiagen | 74106 | |
RNA stabilizing reagents | |||
(RNA later) | Invitrogen | AM7020 | |
(DNA/RNA Shield) | Zymo Research | R1100-50 | |
PCR | |||
Nuclease-free Water (Nuclease-free Water [not DEPC-treated]) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | AM9937 | |
Master mix for first strand cDNA synthesis (LunaScript RT SuperMix Kit) |
New England Biolabs | E3010S | |
DNA amplification master mix (Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix [NEB]) |
New England Biolabs | M0494L | |
Primer (Scheme) (Custom DNA oligos) |
Invitrogen | ||
SPRI Bead Clean-up | |||
SPRI beads (Aline Biosciences PCR Clean DX ) |
Cambio | AL-AC1003-50 | |
Ethanol, Pure Absolute, >99.8% (GC) [Riedel-De Haen] | Merck | 818760 | |
Short Fragment buffer (SFB expansion pack) |
Oxford Nanopore Technologies | EXP-SFB001 | |
DNA Quantification | |||
DNA quantification kit (Qubit® dsDNA HS Assay Kit) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q32854 | |
DNA quantification assay tubes (Qubit™ Assay Tubes) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q32856 | |
End Prep and barcoding (Qubit™ Assay Tubes) |
|||
End Prep master mix (NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module) |
New England Biolabs | E7546L | |
Barcoding kit | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 | |
(Native Barcoding Expansion 1-12) | EXP-NBD104 | ||
(Native Barcoding Expansion 13-24) | EXP-NBD114 | ||
(Native Barcoding Expansion 96) | EXP-NBD196 | ||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 | |
(not compatible) | (not compatible) | ||
(Native Barcoding Kit 24 V14) | SQK-NBD114.24 | ||
(Native Barcoding Kit 96 V14) | SQK-NBD114.96 | ||
Ligation mastermix (Blunt/TA Ligase Master Mix) |
New England Biolabs | M0367S | |
Adapter Ligation | |||
Adapter ligation master mix | |||
(NEBNext Quick Ligation Module) | New England Biolabs | E6056S | |
(NEBNext Ultra II Ligation Module) | New England Biolabs | E7595S | |
(Blunt/TA Ligase Master Mix) | New England Biolabs | M0367S | |
Adapter mix | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 EXP-AMII001 |
|
(Adapter Mix II [AMII]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 EXP-NBA114 |
|
(Native adapter [NA]) | |||
Sequencing | |||
Flowcell priming kit | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 EXP-FLP002 |
|
(Flush Buffer [FB]) | |||
(Flush Tether [FT]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 EXP-FLP004 |
|
(Flow Cell Flush [FCF]) | |||
(Flow Cell Tether [FCT]) | |||
Ligation Sequencing Kit | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 SQK-LSK109 |
|
Adapter Mix (Adapter Mix [AMX]) |
|||
Ligation Buffer (Ligation buffer [LNB]) |
|||
Short Fragment Buffer (Short Fragment buffer [SFB]) |
|||
Sequencing Buffer (Sequencing Buffer [SQB]) |
|||
Elution Buffer (Elution buffer [EB]) |
|||
Loading Beads (Loading Beads [LB]) |
|||
Sequencing Tether (Sequencing Tether [SQT]) |
|||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 SQK-LSK114 |
|
Adapter Mix (Ligation Adapter [LA]) |
|||
Ligation Buffer (Ligation buffer [LNB]) |
|||
Short Fragment Buffer (Short Fragment buffer [SFB]) |
|||
Sequencing Buffer (Sequencing Buffer [SB]) |
|||
Elution Buffer (Elution buffer [EB]) |
|||
Loading Beads (Loading Beads [LIB]) |
|||
Sequencing Tether (Flow Cell Tether [FCT]) |
|||
Library solution (Library solution [LIS]) |
|||
Flush buffer (Flow Cell Flush [FCF]) |
|||
Flow Cell | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 FLO-MIN106D |
|
(Flow Cell [R9.4.1]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 FLO-MIN114 |
|
(Flow Cell [R10.4.1]) | |||
Flow Cell wash | |||
Flowcell wash kit (Flow cell wash kit) |
Oxford Nanopore Technologies | EXP-WSH004 | |
Consummables | |||
Surface decontaminant | |||
(DNA Away Surface Decontaminant, Squeeze Bottle [Molecular Bio]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 7010PK | |
(RNase Away Surface Decontaminant, Bottle [Molecular Bio]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 7002PK | |
PCR 8-Tube Strip 0.2ml, individual cap (PCR 8-Tube Strip 0.2ml, with Individual attached Flat Caps, Sterile, DNAse/RNAse, Pyrogen Free,Natural [Greiner]) |
Greiner | 608281 | |
PCR Tube 0.2ml (PCR Tube 0.2ml, Natural [Domed Cap] Bagged in 500s, Non-Sterile [Greiner]) |
Greiner | 671201 | |
1000µL Filter Tips (500) (Stacked 1000µL Filter Tips [500]) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11977724 | |
100µL Filter Tips (1000) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11947724 | |
10µL Filter Tips (1000) (Stacked 100µL Filter Tips [1000]) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11907724 | |
Reinforced tubes tubes (2ml) with screw caps and o-rings (Fisherbrand™ Bulk tubes) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 15545809 | |
Microcentrifuge tube (1.5ml) (1.5 ml Eppendorf Tubes [500]) |
Eppendorf | 1229888 | |
DNA LoBind Tubes (1.5ml) (DNA LoBind Tubes) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 10051232 | |
Cryobabies labels | |||
Gloves (S/M/L) | |||
Paper towel |