Nanopor Teknolojisi Kullanılarak Kuduz Virüsünün Hızlı Karakterizasyonu için Tüm Genom Dizilimi

Çalışma, Ulusal Tıbbi Araştırma Enstitüsü Tıbbi Araştırma Koordinasyon Komitesi tarafından onaylanmıştır (NIMR/HQ/R.8a/vol. IX/2788), Tanzanya’da Bölgesel İdare ve Yerel Yönetim Bakanlığı (AB.81/288/01) ve Ifakara Sağlık Enstitüsü Kurumsal İnceleme Kurulu (IHI/IRB/No:22-2014); Kenya’daki Nairobi Üniversitesi Tropikal ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (P947/11/2019) ve Kenya Tıbbi Araştırma Enstitüsü (KEMRI-SERU; protokol No. 3268); ve Filipinler’deki Tropikal Tıp Araştırma Enstitüsü (RITM), Sağlık Bakanlığı (2019-023). Nijerya menşeli örneklerin dizilimi, ulusal sürveyansın bir parçası olarak toplanan arşivlenmiş teşhis materyali üzerinde gerçekleştirilmiştir. NOT: Bölüm 1-4 önkoşuldur. Bölüm 5-16, RABV nanopor dizilimi için numuneden diziye ve yorumlamaya iş akışını açıklar (Şekil 1). Protokolde darbeli santrifüjleme gerektiren sonraki adımlar için, 5-15 s boyunca 10-15.000 x g’da santrifüjleyin. 1. Sıralama ve veri analizi için hesaplama ortamı kurulumu Oxford Nanopore Technology (ONT) web sitesini37 açın ve nanopora özgü kaynaklara erişmek için bir hesap oluşturun.Oturum açın ve ONT sıralama ve temel arama yazılımını kurun38. GitHub39’u açın ve bir hesap oluşturun.artic-rabv40 ve MADDOG depoları41’e gidin ve kurulum talimatlarını izleyin. 2. Multipleks astar şemasını tasarlayın veya güncelleyin NOT: Mevcut RABV şemaları artic-rabv deposu40’ta mevcuttur. Yeni bir coğrafi alanı hedeflerken, yeni bir şema tasarlanmalı veya mevcut bir şema ek çeşitliliği içerecek şekilde değiştirilmelidir. Çalışma alanındaki çeşitliliği temsil etmek için bir genom referans seti seçin; bu tipik olarak halka açık bir dizi dizidir (örneğin, NCBI GenBank’tan) veya ön kurum içi verilerdir. NCBI dizilerini ve ilişkili meta verileri filtrelemek ve indirmek için bir RABV dizisi veri kaynağı olan RABV-GLUE42’yi kullanmak için adım 2.1.1’i izleyin.NOT: Tam genomlara sahip referans dizileri seçin (yani, boşluklar ve maskelenmiş bazlar olmadan). Astar tasarımı için referans seti olarak en fazla 10 sekans seçilmesi önerilir. Mevcut dizi verileri eksikse veya çalışma alanını temsil etmiyorsa, Ek Dosya 1’deki 43,44,45 numaralı tavsiyeye bakın.RABV-GLUE’daki Dizi Verileri açılır menüsünden NCBI RABV Dizileri sayfasına gidin. Mevcut tüm verilere erişmek için Kuduz Virüsü (RABV) bağlantısını tıklayın veya ilgilendiğiniz belirli bir türü seçin. İstenen kriterlere (ör. menşe ülke, sıra uzunluğu) uyan filtreler eklemek için filtre seçeneğini kullanın. Dizileri ve meta verileri indirin. Primal Scheme46 tarafından sağlanan talimatları izleyerek multipleks polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için bir primer şeması oluşturun. Düşük kaliteli numuneleri sıralamak için 50 bp örtüşmeye sahip 400 bp’lik bir şema önerilir. Tüm çıktıları indirin ve kaydedin (dosya veya astar adlarını düzenlemeyin).NOT: Şema, bundan böyle ‘indeks referansı’ olarak anılacak olan giriş fasta’daki ilk diziye indekslenecektir (Şekil 2). Primer performansını optimize etme seçenekleri için Ek Dosya 1’e bakın. 3. RAMPART ve ARTIC biyoinformatik boru hatlarını kurun RAMPART ve ARTIC biyoinformatik ardışık düzen için giriş/çıkış dosyalarını yönetmek üzere bir dizin yapısı ayarlamak için Ek Dosya 2’ye bakın. 4. Biyogüvenlik ve laboratuvar kurulumu Potansiyel olarak kuduz pozitif numuneleri biyogüvenlik seviyesi (BSL) 2 veya 3 koşullarında kullanın. Laboratuvar personelinin maruziyet öncesi kuduz aşısını tamamladığından ve Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tavsiyelerine göre bağışıklığın izlenmesinden geçtiğinden emin olun3. Laboratuvar için ulusal veya uluslararası yönergelere uygun özel standart çalışma prosedürlerinin ve risk değerlendirmelerinin yapıldığından emin olun. Gerekli laboratuvar kurulumu: PCR öncesi ve sonrası alanlar arasında fiziksel ayrımı koruyarak kontaminasyonu en aza indirin. Sınırlı alana sahip laboratuvarlarda veya saha içi laboratuvar ortamlarında, kontaminasyonu en aza indirmek için taşınabilir torpido gözü veya geçici laboratuvar istasyonları kullanın. Bu protokolde, aşağıdakiler için ayrı alanlar belirlendiğinden emin olun:Numune ekstraksiyonu: Biyolojik materyali işlemek ve inaktivasyon ve RNA ekstraksiyonu gerçekleştirmek için bir BSL2/3 kabini/torpido gözü kurun. Şablon alanı: Önceden hazırlanmış reaksiyon ana karışımına şablon (RNA/cDNA) eklenmesi için bir BSL1 kabini/torpido gözü kurun. Ana karışım alanı: Reaktif ana karışımlarının hazırlanması için belirlenmiş bir temiz alan (BSL1 kabini/torpido gözü) kurun. Bu alanda şablon olmamalıdır. PCR sonrası alan: Amplikonlar ve dizileme kitaplığı hazırlığı üzerinde çalışmak için ayrı bir alan oluşturun.NOT: Tüm alanlar kullanımdan önce ve sonra bir yüzey dekontaminantı ile temizlenmeli ve ultraviyole (UV) ile sterilize edilmelidir. 5. Saha numunesi toplama ve teşhis NOT: Numuneler, kişisel koruyucu ekipman giyen ve atıfta bulunulan standart prosedürler47,48,49 izlenerek eğitimli ve aşılanmış personel tarafından toplanmalıdır. Numuneyi, Mauti ve ark.50’de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi foramen magnum (yani oksipital yol) yoluyla toplayın. Hızlı tanı testleri ile sahada kuduz teşhisi koyun ve doğrudan floresan antikor testi (DFA), doğrudan hızlı immünohistokimyasal test (DRIT)51,52 veya gerçek zamanlı ters transkripsiyon (RT)-PCR 53 gibi önerilen prosedürleri47 kullanarak laboratuvarda onaylayın. RNA ekstraksiyonu için doğrulanmış pozitif beyin örnekleri kullanın veya 2-3 ay boyunca -20 ° C’de veya daha uzun süre -80 ° C’de bir dondurucuda saklayın. Uygun bir DNA/RNA stabilizasyon ortamı kullanarak depolama ve taşıma için RNA’yı koruyun. 6. Numune hazırlama ve RNA ekstraksiyonu (3 saat) NOT: Numune tipine uygun bir spin kolon bazlı viral RNA ekstraksiyon kiti kullanın. 2 mL’lik bir PCR tüpünü 1,4 mm seramik boncuklarla dolu yaklaşık 200 μL’lik bir tüple doldurarak iki seramik boncuk tüpü hazırlayın ve tüpü etiketleyin. RNA ekstraksiyon kitinde sağlanan önerilen lizis tamponu hacmini etiketli PCR tüpüne ekleyin. Ahşap bir aplikatör kullanarak kuduz enfeksiyonu ile doğrulanmış beyin örneğinden yaklaşık 3 mm’lik bir küp alın ve numune kimliği ve 100 μL nükleaz içermeyen su ile etiketli bir tüpe negatif kontrol etiketli tüpe koyun.NOT: Numune maruziyetini sınırlamak için kapalı tüp boncuk bazlı homojenizasyon kullanın. Mümkün değilse, diğer uygun mekanik bozucular (örn. rotor tabanlı) veya manuel bir mikro tokmak kullanın. Bununla birlikte, bunlar dokuyu bozmak için sert yüzeyde boncuk dövmekten daha az etkili olabilir (doku örnekleri belirli depolama ortamlarında sertleşebilir). Tahta bir aplikatör çubuğu kullanarak beyin dokusunu manuel olarak parçalayın ve ardından tam doku homojenizasyonu sağlanana kadar maksimum hızda girdap yapın. Lizatı üreticinin talimatlarına göre santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir etiketli mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için bir pipet kullanın. Bu süpernatanı yalnızca sonraki adımlarda kullanın. Saflaştırılmış RNA elde etmek için RNA ekstraksiyon kitinin spin kolonu talimatlarını izleyin. Buraya bir negatif ekstraksiyon kontrolü (NEC) ekleyin ve sıralama aşamasına kadar ilerleyin. 7. cDNA hazırlığı (20 dk) Ana karışım alanında, işlenecek numune ve kontrol sayısına göre ilk iplikçik cDNA sentezi için bir ana karışım hazırlayın (yeterli reaktifi sağlamak için ‘luk fazla hacimle; Tablo 1). Bu aşamada şablonsuz bir denetim (NTC) eklenmelidir. 0.2 mL PCR şerit tüplerini etiketleyin ve ana karışımın 5 μL’sini tüplere ayırın. Hazırlanan tüpleri şablon alanına alın. NEC dahil olmak üzere etiketli her tüpe 5 μL RNA ekleyin. NTC’ye 5 μL nükleaz içermeyen su (NFW) ekleyin. Tablo 1’de belirtilen koşulları izleyerek bir termal döngüleyicide inkübe edin.NOT: İsteğe bağlı duraklama noktası: cDNA, gerekirse -20 °C’de 1 aya kadar saklanabilir, ancak PCR’ye geçmek tercih edilir. 8. Primer havuz stoğu hazırlama (1 saat) NOT: Bu adım, yalnızca tek tek primerlerden yeni stoklar yapılırsa gereklidir, bundan sonra önceden hazırlanmış stok çözeltileri kullanılabilir. Ana karışım alanında 100 μM stoktan oluşan bir astar havuzu hazırlayın. Liyofilize primerleri, her biri 100 μM konsantrasyonda 1x tris-EDTA (TE) tamponunda veya NFW’de yeniden süspanse edin. İyice girdap yapın ve aşağı doğru döndürün.NOT: Aşağıdaki adımlarda, amplikon örtüşmelerini çevreleyen primerler arasındaki etkileşimleri önlemek için tek tek primerler (Havuz A olarak adlandırılır) ve çift numaralı (Havuz B olarak adlandırılır) olmak üzere iki primer havuzuna ayrılır. Bu primer havuzları, hedef genomu kapsayan üst üste binen 400 bp amplikon üretir. Tüm tek sayılı astarları bir tüp rafına yerleştirin. “Primer şema adı – Havuz A (100 μM)” etiketli 1,5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpüne her primerden 5 μL ekleyerek bir primer havuzu stoğu oluşturun. İşlemi tüm çift numaralı primerler için tekrarlayın ve “primer şema adı – Havuz B (100 μM)” olarak etiketleyin. 10 μM primer stokları oluşturmak için her bir primer havuzunu moleküler dereceli suda 1:10 oranında seyreltin.NOT: 10 μM primer seyreltmelerinin birden fazla alikotunu yapın ve bozunma veya kontaminasyon durumunda bunları dondurun. 9. Multipleks PCR (5 saat) Ana karışım alanındaki her primer havuzu için bir tane olmak üzere iki PCR ana karışımı hazırlayın.Astar başına 0.015 μM’lik bir son konsantrasyon kullanın. Aşağıdaki formülü kullanarak PCR reaksiyonu için gerekli primer havuzu hacmini hesaplayın (Tablo 2):Primer havuzu hacmi = primer sayısı x reaksiyon hacmi x 0.015/konsantrasyon (μM) primer stoğu Şablon alanındaki etiketli PCR şerit tüplerine Havuz A ana karışımı ve Havuz B ana karışımının her biri 10 μL’dir. Her numune için, karşılık gelen etiketli primer Havuz A ve B reaksiyonlarının her birine 2.5 μL cDNA (3. adımdan itibaren) ekleyin. Fazla cDNA -20 °C’de saklanabilir. Hafifçe vurarak ve nabız santrifüjü ile karıştırın. Numuneleri bir PCR makinesinde Tablo 2’de belirtilen koşullarla inkübe edin.NOT: Program, 5 dakikalık uzun tavlama süresi (yüksek primer sayısı nedeniyle gereklidir) ve uzatma için yeterli olan amplikonların kısa uzunluğu (400 bp) nedeniyle belirli bir uzatma adımı içermez. 10. PCR temizleme ve miktar tayini (3,5 saat) Bu noktadan itibaren tüm çalışmaları PCR sonrası alanda gerçekleştirin. Aliquot katı fazlı tersinir immobilizasyon (SPRI) boncuklarını ana şişeden mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin. 4 °C’de saklayın. Bir SPRI boncuğu alikotunu oda sıcaklığına (RT; ~ 20 ° C) ısıtın ve boncuklar çözelti içinde tamamen yeniden süspanse olana kadar iyice girdap yapın. 1,5 mL’lik tüplerde, her numune için primer Pool A ve primer Pool B PCR ürünlerini birleştirin. Gerekirse, hacmi 25 μL’ye getirmek için su ekleyin. Her numuneye 25 μL SPRI boncuk ekleyin (1:1 boncuk: numune oranı). Yukarı ve aşağı pipetleyerek veya tüpe hafifçe vurarak karıştırın. RT’de 10 dakika inkübe edin, ara sıra tüpleri ters çevirin veya hafifçe vurun. Boncuklar ve çözelti tamamen ayrılana kadar manyetik bir rafa yerleştirin. Süpernatanı çıkarın ve atın, boncuk peletini rahatsız etmemeye dikkat edin. İki kez% 80 etanol ile yıkayın (RT’ye ısıtılır).Pelete 200 μL etanol ekleyin. Boncukların düzgün bir şekilde yıkandığından emin olmak için 30 saniye bekleyin. Boncuk peletine dokunmamaya çalışarak süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın. Peleti ikinci kez yıkamak için 10.8.1-10.8.2 adımlarını tekrarlayın. 10 μL’lik bir uç kullanarak tüm etanol izlerini çıkarın. İz etanol buharlaşana kadar havayla kurutun (küçük boncuklarla bu hızlı bir şekilde gerçekleşir, ~ 30 s); Bu olduğunda, pelet parlaktan mata gitmelidir. Aşırı kurutmamaya dikkat edin (pelet çatlıyorsa, çok kurudur), çünkü bu DNA iyileşmesini etkileyecektir. Boncukları 15 μL NFW’de yeniden süspanse edin ve RT’de (manyetik rafın dışında) 10 dakika inkübe edin. Manyetik rafa geri dönün ve süpernatanı (temizlenmiş ürün) 1,5 mL’lik yeni bir tüpe aktarın. Her numunenin ayrı bir tüpte (2 μL ürün + 18 μL NFW) 1:10 seyreltmesini hazırlayın.NOT: Çapraz bulaşmayı önlemek için bu aşamada çok dikkatli olun. Bir seferde yalnızca bir amplikon tüpü açık olsun. Önce tüplere 18 μL su koyun (temiz bir ana karışım alanında). protocols.io 54,55’te açıklandığı gibi, oldukça hassas ve spesifik bir florometre kullanarak seyreltilmiş her numunenin DNA konsantrasyonunu ölçün. 11. Normalleştirme (30 dk) Toplam 5 μL hacminde her bir numunenin 200 fmol’ü için gereken seyreltilmiş (veya saf) numune hacmini hesaplamak için her numunenin normalizasyon şablonunu (Ek Dosya 3) ve DNA konsantrasyonunu (ng/μL) kullanın. Yeni PCR tüplerini etiketleyin ve normalleştirilmiş DNA elde etmek için hesaplanmış NFW hacimleri ve numune ekleyin. 200 fmol elde etmek için 5 μL’den fazla seyreltilmiş numune gerekiyorsa, seyreltilmemiş (saf) numuneler için hesaplanan hacmi kullanın.NOT: İsteğe bağlı duraklama noktası: Bu noktada, temizlenmiş PCR ürünü 4 °C’de 1 haftaya kadar saklanabilir veya gerekirse daha uzun süreli saklama için -20 °C’ye yerleştirilebilir. 12. Son hazırlık ve barkodlama (1,5 saat) NOT: Sonraki adımlar, nano gözeneklere özgü barkodlama ve ligasyon dizileme kitlerinden belirli reaktiflerin kullanıldığını varsayar (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın). Protokol farklı kimya sürümleri arasında aktarılabilir, ancak kullanıcılar üretici talimatlarına göre uyumlu kitleri kullanmaya özen göstermelidir. Son onarım ve dA-tailingTablo 3’te belirtilen her numune için son hazırlık reaksiyonunu ayarlayın. Numune sayısına göre bir ana karışım hazırlayın (artı fazlalık). Reaktifler viskoz olduğundan pipetleme yaparken dikkatli olun. Normalize DNA’nın her tüpüne (5 μL) 5 μL ana karışım ekleyin. Toplam reaksiyon karışımı 10 μL olmalıdır. Uçları her seferinde değiştirin ve bir seferde yalnızca bir tüpü açık tutun. Tablo 3’te belirtilen koşullar altında bir termal döngüleyicide inkübe edin. BarkodlamaBarkodlama kitindeki barkodları 1,25 μL/tüpte PCR şerit tüplerine aktarın ve her numuneye atanan barkodu kaydedin. 0.75 μL uç hazırlanmış numuneyi atanmış barkod alikotuna ekleyin. Numune sayısına göre (artı fazla) bir ligasyon ana karışımı hazırlayın (Tablo 4). Sonuna kadar hazırlanmış numune + barkodlara 8 μL ligasyon ana karışımı ekleyerek toplam 10 μL reaksiyon verin. Tablo 4’te belirtilen koşulları kullanarak bir termal döngüleyicide inkübe edin. SPRI boncuk temizleme ve DNA miktar tayiniKısa parça tamponunu (SFB) RT’de çözün, girdaplama, darbe santrifüjü ile karıştırın ve buz üzerine yerleştirin. Tüm barkodlu numuneleri 1,5 mL’lik bir lobind mikrosantrifüj tüpünde bir araya getirin. Temizleme hacmini kullanılamayacak kadar büyük hale getirmemek için, her bir yerel barkodlama reaksiyonundan 12-24 numune (10 μL/numune), 48 numuneye kadar (5 μL/numune) veya 96 numuneye (2,5 μL/numune) kadar havuzlayın. Barkodlu havuza 0,4x hacimde SPRI boncuk ekleyin. Hafifçe karıştırın (hafifçe vurarak veya pipetleyerek) ve RT’de 5 dakika inkübe edin. Boncuklar peletlenene ve süpernatan tamamen berraklaşana kadar (~2 dakika) numuneleri bir mıknatıs üzerine yerleştirin. Süpernatanı çıkarın ve atın. Boncukları rahatsız etmemeye dikkat edin. 250 μL SFB ile iki kez yıkayın.Tüpü mıknatıstan çıkarın ve peleti 250 μL SFB’de tamamen yeniden süspanse edin. 30 saniye inkübe edin, darbe santrifüjü yapın ve mıknatısa geri dönün. Süpernatanı çıkarın ve atın. İkinci bir SFB yıkaması gerçekleştirmek için 12.3.5 adımını tekrarlayın. Darbe santrifüjü yapın ve kalan SFB’yi çıkarın. Peleti yıkamak için 200 μL (RT) etanol ekleyin. Etanolü çıkarın ve atın, boncuk peletini rahatsız etmemeye dikkat edin. 30 saniye boyunca veya pelet parlaklığını kaybedene kadar havayla kurutun. RT’de 22 μL NFW’de 10 dakika boyunca yeniden süspanse edin. Mıknatısın üzerine yerleştirin, ~ 2 dakika bekletin, ardından çözeltiyi dikkatlice çıkarın ve temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha önce tarif edildiği gibi DNA konsantrasyonunu elde etmek için 1 μL kullanın (adım 10.13).NOT: İsteğe bağlı duraklama noktası: Bu noktada, kitaplık 4 °C’de 1 haftaya kadar veya daha uzun süreli depolama için -20 °C’de saklanabilir, ancak adaptör ligasyonu ve sıralamasına devam edilmesi tercih edilir. 13. Sıralama (maksimum 48 saat) Bilgisayarı hazırlayın (Önkoşullar bölüm 1-4’e de bakın).Yeni verileri depolamak için yeterli alan olup olmadığını (en az 150 GB), eski çalıştırmalardan elde edilen verilerin silinmeden önce yedeklendiğini/bir sunucuya taşındığını ve MinKNOW’un en son sürümünün yüklendiğini kontrol edin. Depolanan akış hücresini buzdolabından çıkarın ve RT’ye ulaşmasına izin verin. Adaptör ligasyonu (1 saat)Adaptör karışımını ve ligaz darbesini santrifüjleyin ve buzun üzerine yerleştirin. RT’de çözünme elüsyon tamponu (EB), SFB ve ligasyon tamponu. Girdap, nabız santrifüjü ile karıştırın ve buz üzerine yerleştirin. Adaptör ligasyon ana karışımını hazırlayın (Tablo 5), reaktifleri belirtilen sırayla düşük bağlamalı bir tüpte birleştirerek.NOT: Adaptör ligasyonu ana karışım reaktifleri için alternatifler (Tablo 5), laboratuvardaki mevcudiyete bağlı olarak kullanılabilir. Alternatiflerin listesi için Ek Dosya 3’e ve Malzeme Tablosuna bakın. 200 fmol’e eşdeğer DNA kitaplığı hacmini elde etmek için Ek Dosya 3 çalışma sayfasındaki hesaplamayı kullanın. 20 μL’den az hesaplanırsa, 20 μL’ye kadar NFW ekleyin. Hafifçe vurma ve nabız santrifüjü ile karıştırın. RT’de 20 dakika inkübe edin.NOT: İnkübasyon sırasında akış hücresini hazırlamaya başlayın (bölüm 13.5). SPRI boncukları kullanarak temizleyin (daha önceki temizliklerde olduğu gibi etanol kullanmayın).Örneklere 0,4x hacimde SPRI boncukları (RT) ekleyin. RT’de 10 dakika inkübe edin, karıştırmaya yardımcı olmak için aralıklı olarak hafifçe hafifçe vurun. Boncuklar ve çözelti tamamen ayrılana kadar (~5 dakika) mıknatısın üzerine yerleştirin. Süpernatanı çıkarın ve atın; Boncuk peletini rahatsız etmemeye dikkat edin. 125 μL SFB ile iki kez yıkayın. Pelet, bir pipetle karıştırarak 125 μL SFB ile tamamen yeniden süspanse edin. 30 saniye inkübe etmeye bırakın. Tüp tabanında sıvı toplamak ve mıknatıs üzerine yerleştirmek için darbe santrifüjü. Süpernatanı çıkarın ve atın. Peleti ikinci kez yıkamak için 13.4.4-13.4.5 adımlarını tekrarlayın. Nabız santrifüjü yapın ve fazla SFB’yi çıkarın. 15 μL EB’de tekrar süspanse edin ve RT’de 10 dakika inkübe edin. ~ 2 dakika boyunca mıknatısa geri dönün ve ardından çözeltiyi dikkatlice 1.5 mL’lik temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha önce adım 10.13’te açıklandığı gibi, ayrıştırılmış kitaplığın 1 μL’sini ölçünNOT: En iyi sonuçlar için doğrudan MinION sıralamasına geçin; ancak son kütüphane gerekirse EB’de 4 °C’de 1 haftaya kadar saklanabilir. Bir akış hücresi kalite denetimi çalıştırın.Sıralama cihazını bir dizüstü bilgisayara bağlayın ve sıralama yazılımını açın. Akış hücresi türünü seçin ve ardından Akış Hücresini Denetle ve Testi Başlat’ı tıklatın. Tamamlandığında, toplam aktif (yani canlı) gözenek sayısı görüntülenecektir. Yeni bir akış hücresi >800 aktif gözeneğe sahip olmalıdır; Olmazsa, değiştirme için üreticiyle iletişime geçin. Akış hücresinin hazırlanması ve yüklenmesi (20 dk)Aşağıdaki reaktifleri RT’de çözün ve ardından sıralama tamponu, bir yıkama bağlantısı, yıkama tamponu ve yükleme boncuklarını buz üzerine yerleştirin. Sıralama tamponunu girdap haline getirin ve tamponu yıkayın, darbe santrifüjü yapın ve buz üzerine yerleştirin. Yıkama bağını darbeli santrifüjleyin ve pipetleme ile karıştırın; Sonra buzun üzerine yerleştirin. Bir akış hücresi hazırlama kitinden doğrudan yıkama tamponu tüpüne 30 μL yıkama ipi ekleyerek akış hücresi hazırlama karışımını hazırlayın ve pipetleme ile karıştırın. Yükleme boncuklarını, hızlı bir şekilde yerleştikleri için kullanmadan hemen önce pipetleyerek karıştırın. Yeni bir tüpte, Tablo 5’te belirtildiği gibi sıralama için son kitaplık seyreltmesini hazırlayın.NOT: DNA kitaplığının hacmini 50 fmol’e eşdeğer olarak elde etmek için Ek Dosya 3 çalışma sayfasındaki hesaplamayı kullanın. 12 μL’den az hesaplanırsa, 12 μL’ye kadar EB ekleyin. Sıralama cihazı kapağını geri çevirin ve hazırlama portu kapağını, hazırlama portu görünecek şekilde saat yönünde kaydırın (Şekil 3) Bir P1000 pipeti 200 μL’ye ayarlayarak hava kabarcıklarını dikkatlice çıkarın, ucu hazırlama portuna yerleştirin ve pipet ucuna giren küçük bir hacim görülene kadar tekerleği çevirin (maksimum dönüş 230 μL’ye kadar). Kabarcıkları önlemeye dikkat ederek, 800 μL akış hücresi hazırlama karışımını hazırlama portu aracılığıyla akış hücresine yükleyin. 5 dakika bekletin. Numune portu kapağını yavaşça kaldırın ve bir P1000 pipet kullanarak 200 μL astarlama karışımını astarlama portu üzerinden akış hücresine yükleyin. Yüklemeden önce kitaplık karışımını yukarı ve aşağı pipetleyin, ana karışımdaki yükleme boncuklarının yüklemeden önce yeniden askıya alındığından emin olun. 75 μL kütüphane karışımını numune portu üzerinden akış hücresine damla damla yükleyin. Bir sonrakini eklemeden önce her damlamanın bağlantı noktasına aktığından emin olun. S’yi yerine takınampport kapağı nazikçe yerleştirin ve pung’un s’ye girdiğinden emin olun.ampport. Doldurma portunu kapatın ve sıralama cihazı kapağını değiştirin. Sıralama çalışması (maksimum 48 saat)Sıralama cihazını dizüstü bilgisayara bağlayın ve sıralama yazılımını açın. Başlat’a tıklayın ve ardından Sıralamayı Başlat’a tıklayın. Yeni Deneme’yi tıklatın ve çalıştırma parametrelerini ayarlamak için sıralama yazılımı grafik kullanıcı arabirimi (GUI) iş akışını izleyin. Deney adını ve numune kimliğini (ör. rabv_run1) yazın ve açılır menüden Akış Hücresi Tipi’ni seçin. Kit seçimine devam edin ve kullanılan ilgili ligasyon sıralama kitini ve yerel barkodlama kitini seçin. Seçenekleri Çalıştırmaya Devam Edin. Çalıştırmanın belirli bir saat sayısından sonra otomatik olarak durdurulması istenmediği sürece varsayılanları koruyun (çalıştırmalar herhangi bir zamanda manuel olarak durdurulabilir). Basecalling’e devam edin. Bilgi işlem kaynaklarına göre Basecalling’i Açma veya Kapatma seçeneğini belirleyin (bkz. bilgisayar kurulumu). Barkodlama altında Seçenekleri Düzenle’yi seçin ve Barkodun Her İki Ucunun açık olduğundan emin olun. Kaydedin ve çıktı bölümüne devam edin. Varsayılanları kabul edin ve son gözden geçirmeye devam edin, ayarları kontrol edin ve ayrıntıları çalışma sayfasına kaydedin (Ek Dosya 3). Başlat’a tıklayın.NOT: Akış hücresi yeniden kullanılıyorsa, başlangıç voltajını (çalıştırma seçeneklerinin gelişmiş bölümünde), Ek Dosya 3’teki şemada gösterildiği gibi ayarlayın. İlk aktif kanalları kaydedin – bu, kalite kontrol (QC) kontrolünden önemli ölçüde düşükse, sıralama yazılımını yeniden başlatın. Hala düşükse, bilgisayarı yeniden başlatın. Yaklaşık bir gözenek doluluğu sağlamak için ilk kanalları tek gözeneklere karşı iplikçik halinde kaydedin. Bu sayı dalgalanacaktır, bu nedenle yaklaşık bir değer verin. İlerledikçe koşuyu izleyin. 14. Canlı ve çevrimdışı temel arama NOT: Bu talimatlar, artic-rabv deposunda önceden var olan dizin yapısının sağlandığını ve protokolün Önkoşullar bölüm 1 ve 3’e uyulduğunu varsayar. Yerel dosya sisteminizde, tüm analiz çıktılarınızı depolayacağınız analiz adlı yeni bir dizin oluşturun. Daha fazla düzenlemek için: MinKNOW’a run_name olarak sağlanan örnek kimliği kullanarak projenizin adıyla bir alt dizin oluşturun ve bunun içinde çalıştırma için yeni bir dizin oluşturun. Bunu tek bir komutla aşağıdaki gibi yapın:mkdir -pAnaliz/project_name/run_nameArdından konumuna gidin:CDyol/analiz/project_name/run_name Canlı temel aramaNOT: Nanopor taban çağrısını gerçek zamanlı olarak gerçekleştirmek için dizüstü bilgisayarlar NVIDIA CUDA uyumlu bir grafik işleme birimi (GPU) gerektirir. GPU temel arama kurulumu için talimatların guppy protokolü56 kullanılarak gerçekleştirildiğinden emin olun.Çalıştırma kurulumu sırasında canlı temel çağrıyı açın. Aşağıdaki talimata göre sıralama kapsamını gerçek zamanlı olarak izlemek için RAMPART’ı kullanın. Bilgisayarın terminalinde artic-rabv conda ortamını etkinleştirin:Conda Artic-RABV’yi etkinleştirin run_name dizini içinde sur çıktısı için yeni bir dizin oluşturun ve içine gidin:cd / yol / analiz / project_name / run_namemkdir rampart_outputcd rampart_output Barkodları ve numune adlarını eşleştirmek için bir barkod.csv dosyası oluşturun. Her barkod için bir satır olmalı ve yalnızca “barkod” ve “örnek” başlıklarıyla kitaplıkta bulunan barkodları belirtmelidir. artic-rabv dizinindeki örneği izleyin:analiz / example_project / example_run / rampart_output / barkodlar.csv Çalıştırma için MinKNOW çıkışında ilgili protokol klasörünü ve fastq_pass klasörün yolunu sağlayarak RAMPART’ı başlatın:rampart –protocol /path/rampart/scheme_name_V1_protocol – basecalledPath Bir tarayıcı penceresi açın ve URL kutusunda localhost:3000 adresine gidin. Sonuçlar ekranda görünmeden önce yeterli verinin temel çağrılmasını bekleyin. Çevrimdışı temel arama (çalıştırma sonrası gerçekleştirilir)Canlı temel arama ayarlanmadıysa, MinKNOW’dan gelen çıktı ham sinyal verisi (fast5 dosyaları) olacaktır. Koşu sırasında RAMPART kullanılamayacaktır. fast5 dosyalarını guppy kullanarak çalıştırma sonrası temel verilere (fastq dosyaları) dönüştürün (Önkoşullar adım 1.1.1’deki kuruluma bakın). RAMPART’ı tabanda post-hoc çalıştırın veri denir. Lepistes basecaller’ı çalıştırın:guppy_basecaller -c dna_r9.4.1_450bps_fast.cfg -i /path/to/reads/fast5_* -s /path/analysis/project_name/run_name -x auto -r-c, temel çağırma modelini belirtmek için yapılandırma dosyasıdır, -i giriş yoludur, -s kaydetme yoludur, -x, GPU aygıtı tarafından temel çağrıyı belirtir (guppy’nin bilgisayar sürümünü kullanıyorsanız hariç tutun) ve -r, giriş dosyalarını özyinelemeli olarak aramayı belirtir.NOT: Yapılandırma dosyası (.cfg), _fast _hac ile değiştirilerek yüksek doğrulukta bir temel çağırıcıya değiştirilebilir, ancak bu çok daha uzun sürecektir. 15. Akış hücrelerinin yıkanması Akış hücreleri, gözenekler hala canlıysa, yeni kitaplıkları sıralamak için yıkanabilir ve yeniden kullanılabilir. ONT akış hücresi yıkama protokolü57’de yıkama talimatlarına bakın. 16. Analiz ve yorumlama ARTIC biyoinformatik boru hattı ile konsensüs dizisi oluşturmaHam fast5 veya basecalled fastq dosyalarından konsensüs dizileri oluşturmak için rabv_protocols klasöründeki artic-rabv GitHub deposu40’ta ayrıntılı olarak açıklanan talimatları izleyin.NOT: Daha fazla rehberlik için Artic boru hattı – Çekirdek boru hattı58’e bakın. İsteğe bağlı: Amplikon başına ortalama okuma derinliğini analiz edin.Ek Dosya 1’e başvurarak artic-rabv deposunda bulunan komut dosyalarını uyarlayın. Kısaca, SAMtools59 ve R’de çizilen nükleotid başına kapsam kullanılarak derinlemesine istatistikler oluşturulur. GLUE kullanarak filogenetik analizRABV_GLUE 42’den itibaren, Analiz > Genotipleme ve Yorumlama sekmesini seçin > Dosya Ekle’yi seçin ve konsensüs dizilerinin fasta dosyasını seçin. Gönder’i tıklayın ve bekleyin. Analizler tamamlandıktan sonra, sınıf ve alt sınıf atamalarını, gen başına kapsamı, referans dizilerinden varyasyonu ve en yakın akrabayı gösteren Analizi Göster düğmesi tıklanabilecektir. İlgili bağlamsal diziler, Clade’e Göre Dizi Verileri > NCBI Dizileri bölümünde de tanımlanabilir. Tanımlanan sınıfı seçin veya mevcut tüm dizileri görmek için Kuduz Virüsü’ne (RABV) tıklayın. İlgili diziler için filtreleyin (ör. menşe ülke). Analiz ve karşılaştırma için bu dizileri ve ilgili meta verileri indirin. MADDOG41 kullanarak soy atamasıEn güncel sürümle çalıştığınızdan emin olmak için MADDOG deposunu GitHub’dan çekin. Yerel MADDOG deposunda (daha önce Önkoşullar bölümünde oluşturulmuş) çalıştırma adı olarak adlandırılan bir atama klasörü oluşturun. Klasörün içine, konsensüs dizilerini içeren fasta dosyasını ekleyin. Klasöre bir meta veri dosyası ekleyin.NOT: Bu dosya, ‘ID’, ‘country’, ‘year’ ve ‘assignment’ adlı 4 sütundan oluşan, sıra kimliklerini, örneklemenin yapıldığı ülkeyi ve numunenin toplandığı yılı detaylandıran bir csv olmalı, ‘assignment’ sütunu ise boş olmalıdır. Komut satırı arayüzünde conda ortamını etkinleştirin: conda MADDOG’u etkinleştirin. Komut satırı arayüzünde MADDOG depo klasörüne gidin. Başlangıçta, olası anormallikleri kontrol etmek ve daha uzun köken belirleme adımını çalıştırmanın uygun olup olmayacağını belirlemek için dizilerde köken ataması yapın. Bunun için komut satırına şunu yazın: sh assignment.sh. İstendiğinde, depoyu çektiğinizi ve MADDOG’un en güncel sürümüyle çalıştığınızı belirtmek için Y girin. İstendiğinde, fasta dosyasını içeren MADDOG depo klasöründeki klasörün adını girin. Köken ataması tamamlandığında klasörünüzdeki çıkış dosyasını denetleyin. Çıktı beklendiği gibiyse ve aynı kökene atanmış birden çok dizi varsa, köken atamasını çalıştırın. Köken ataması çalıştırıyorsanız, yeni oluşturulan atama çıktı dosyasını silin. Terminalde, MADDOG depo klasörünün içinde sh designation.sh komutunu çalıştırın. İstendiğinde, depoyu çektiğinizi ve MADDOG’un en güncel sürümüyle çalıştığınızı belirtmek için Y girin. İstendiğinde, fasta dosyasını ve meta verileri içeren MADDOG depo klasörüne klasör adını girin. Bu, her dizi hakkında soy bilgilerini, yeni ve ilgili önceki dizilerin bir filogenisini (16.3.6’dan itibaren), soylar hakkında hiyerarşik bilgileri ve potansiyel olarak ortaya çıkan soyların ve yetersiz örnekleme alanlarının ayrıntılarını verir.NOT: Protokolün, kullanımın ve çıktıların tüm ayrıntıları Campbell ve ark.60’ta bulunabilir. İlk analiz tamamlandığında, ortaya çıkan ve az örneklenmiş kökenleri de test etmeniz istenirse, gerekirse Y girin. Aksi takdirde, N girin. Yeni bulunan kökenleri onaylamanız istenirse, Y girin ve ortaya çıkan NEXT_STEPS.eml dosyasındaki yönergeleri izleyin. Aksi takdirde, N girin.