Sequenzierung des gesamten Genoms zur schnellen Charakterisierung des Tollwutvirus mittels Nanoporentechnologie
Summary
Hier stellen wir einen schnellen und kostengünstigen Workflow zur Charakterisierung von Tollwutvirusgenomen (RABV) mit Hilfe der Nanoporentechnologie vor. Der Arbeitsablauf soll die genomikgestützte Überwachung auf lokaler Ebene unterstützen und Informationen über zirkulierende RABV-Linien und deren Einordnung in regionale Phylogenien liefern, um Maßnahmen zur Tollwutbekämpfung zu steuern.
Abstract
Genomische Daten können verwendet werden, um die Übertragung und geografische Ausbreitung von Infektionskrankheiten zu verfolgen. Die für die genomische Überwachung erforderliche Sequenzierungskapazität ist jedoch in vielen Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen (LMICs) nach wie vor begrenzt, da die durch Hunde vermittelte Tollwut und/oder die durch Wildtiere wie Vampirfledermäuse übertragene Tollwut große Bedenken für die öffentliche Gesundheit und die Wirtschaft aufwirft. Wir präsentieren hier einen schnellen und kostengünstigen Workflow von der Probe über die Sequenz bis zur Interpretation unter Verwendung der Nanoporentechnologie. Die Protokolle für die Probenentnahme und die Diagnose von Tollwut werden kurz beschrieben, gefolgt von Details des optimierten Arbeitsablaufs bei der Sequenzierung des gesamten Genoms, einschließlich des Primerdesigns und der Optimierung für die Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion (PCR), der Vorbereitung einer modifizierten, kostengünstigen Sequenzierungsbibliothek, der Sequenzierung mit Live- und Offline-Basenaufruf, der Bestimmung genetischer Abstammungslinien und der phylogenetischen Analyse. Die Implementierung des Workflows wird demonstriert und kritische Schritte für den lokalen Einsatz werden hervorgehoben, wie z. B. die Pipeline-Validierung, die Primer-Optimierung, die Einbeziehung von Negativkontrollen und die Verwendung öffentlich zugänglicher Daten und genomischer Tools (GLUE, MADDOG) zur Klassifizierung und Platzierung innerhalb regionaler und globaler Phylogenien. Die Bearbeitungszeit für den Workflow beträgt 2-3 Tage, und die Kosten reichen von 25 USD pro Probe für einen 96-Probenlauf bis zu 80 USD pro Probe für einen 12-Sample-Lauf. Wir kommen zu dem Schluss, dass die Einrichtung einer genomischen Überwachung von Tollwutviren in LMICs machbar ist und Fortschritte in Richtung des globalen Ziels von null durch Hunde verursachten Tollwuttodesfällen beim Menschen bis 2030 sowie eine verbesserte Überwachung der Ausbreitung von Wildtier-Tollwut unterstützen kann. Darüber hinaus kann die Plattform für andere Krankheitserreger angepasst werden, was zum Aufbau einer vielseitigen genomischen Kapazität beiträgt, die zur Vorbereitung auf Epidemien und Pandemien beiträgt.
Introduction
Das Tollwutvirus (RABV) ist ein Lyssavirus aus der Familie der Rhabdoviridae , das bei Säugetieren eine tödliche neurologische Erkrankung verursacht1. Obwohl Tollwut zu 100 % durch Impfungen vermeidbar ist, bleibt sie in endemischen Ländern ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit und die Wirtschaft. Von den schätzungsweise 60.000 Tollwuttoten beim Menschen pro Jahr entfallen über 95 % auf Afrika und Asien, wo Hunde das wichtigste Reservoir sind2. Im Gegensatz dazu hat die Impfung von Hunden in Westeuropa, Nordamerika und weiten Teilen Lateinamerikas zur Eliminierung der durch Hunde vermittelten Tollwut geführt. In diesen Regionen sind die Tollwutreservoirs heute auf Wildtiere wie Fledermäuse, Waschbären, Stinktiere und wilde Caniden beschränkt3. In ganz Lateinamerika ist die gewöhnliche Vampirfledermaus eine problematische Quelle für Tollwut, da sie während der nächtlichen Blutfütterung regelmäßig von Fledermäusen auf Menschen und Nutztiere übertragenwird 4. Die jährlichen globalen wirtschaftlichen Auswirkungen von Tollwut werden auf 8,6 Milliarden US-Dollar geschätzt, wobei die Verluste an Viehbeständen 6 % ausmachen5.
Sequenzdaten von viralen Krankheitserregern in Kombination mit Metadaten zum Zeitpunkt und zur Quelle von Infektionen können robuste epidemiologische Erkenntnisse liefern6. Für RABV wurde die Sequenzierung verwendet, um den Ursprung von Ausbrüchen zu untersuchen7,8, Wirtsassoziationen mit Wildtieren oder Haushundenzu identifizieren 8,9,10,11,12 und Quellen menschlicher Fälle zu verfolgen 13,14. Ausbruchsuntersuchungen mittels phylogenetischer Analysen haben ergeben, dass die Tollwut in der ehemals tollwutfreien Provinz Bali, Indonesien, durch eine einzige Einschleppung aus den nahe gelegenen Endemiegebieten Kalimantan oder Sulawesi entstandenist 15. In der Zwischenzeit wurde auf den Philippinen nachgewiesen, dass ein Ausbruch auf der Insel Tablas in der Provinz Romblon von der Hauptinsel Luzon16 eingeschleppt wurde. Virale Genomdaten wurden auch verwendet, um die Übertragungsdynamik von Krankheitserregern besser zu verstehen, die für gezielte Bekämpfungsmaßnahmen in der Region erforderlich ist. Zum Beispiel veranschaulicht die genomische Charakterisierung von RABV die geographische Häufung der Kladen 17,18,19, die Kozirkulation von Abstammungslinien 20,21,22, die durch den Menschen vermittelte virale Bewegung 17,23,24 und die Metapopulationsdynamik 25,26.
Die Überwachung von Krankheiten ist eine wichtige Funktion der genomischen Überwachung, die mit der weltweiten Erhöhung der Sequenzierungskapazität als Reaktion auf die SARS-CoV-2-Pandemie verbessert wurde. Die genomische Überwachung hat die Echtzeitverfolgung der besorgniserregenden SARS-COV-2-Varianten27,28 und die damit verbundenen Gegenmaßnahmen unterstützt6. Fortschritte in der zugänglichen Sequenzierungstechnologie, wie z. B. der Nanoporentechnologie, haben zu verbesserten und erschwinglicheren Protokollen für die schnelle Sequenzierung von menschlichen 29,30,31,32 und tierischen33,34,35 Krankheitserregern geführt. In vielen tollwutendemischen Ländern gibt es jedoch immer noch Hindernisse für die Operationalisierung der genomischen Überwachung von Krankheitserregern, wie die globalen Unterschiede in der SARS-CoV-2-Sequenzierungskapazität zeigen36. Einschränkungen in der Laborinfrastruktur, in den Lieferketten und im technischen Wissen machen die Etablierung und Routineisierung der genomischen Überwachung zu einer Herausforderung. In diesem Artikel zeigen wir, wie ein optimierter, schneller und kostengünstiger Arbeitsablauf für die Sequenzierung des gesamten Genoms für die RABV-Überwachung in ressourcenbegrenzten Umgebungen eingesetzt werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein zugänglicher RABV-, Nanoporen-basierter Sequenzierungs-Workflow für das gesamte Genom wurde von Brunker et al.61 unter Verwendung von Ressourcen aus dem ARTIC-Netzwerk46 entwickelt. Hier stellen wir einen aktualisierten Workflow mit vollständigen Schritten von der Probe über die Sequenz bis zur Interpretation vor. Der Arbeitsablauf beschreibt die Vorbereitung von Hirngewebeproben für die Sequenzierung des gesamten Genoms, stellt eine Bioinformatik-Pipeline zur Verarbeitung von Lesevorgängen und zur Generierung von Konsensussequenzen vor und hebt zwei tollwutspezifische Werkzeuge hervor, um die Zuordnung von Abstammungslinien zu automatisieren und den phylogenetischen Kontext zu bestimmen. Der aktualisierte Workflow bietet auch umfassende Anweisungen für die Einrichtung geeigneter Computer- und Laborarbeitsbereiche mit Überlegungen zur Implementierung in verschiedenen Kontexten (einschließlich ressourcenarmer Einstellungen). Wir haben die erfolgreiche Implementierung des Workflows sowohl in akademischen als auch in Forschungsinstituten in vier RABV-endemischen LMICs ohne oder mit eingeschränkter genomischer Überwachungskapazität demonstriert. Der Workflow hat sich als widerstandsfähig für die Anwendung in verschiedenen Umgebungen erwiesen und ist für Benutzer mit unterschiedlichem Fachwissen verständlich.
Dieser Workflow für die RABV-Sequenzierung ist das umfassendste öffentlich verfügbare Protokoll (das die Schritte von der Probe über die Sequenz bis zur Interpretation abdeckt) und speziell angepasst wurde, um sowohl die Anlauf- als auch die Betriebskosten zu senken. Der Zeit- und Kostenaufwand für die Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung mit der Nanoporentechnologie ist im Vergleich zu anderen Plattformen, wie z. B. Illumina61, stark reduziert, und kontinuierliche Technologieentwicklungen verbessern die Sequenzqualität und -genauigkeit, um mit Illumina62 vergleichbar zu sein.
Dieses Protokoll ist so konzipiert, dass es in verschiedenen ressourcenarmen Kontexten widerstandsfähig ist. Durch die Bezugnahme auf die Anleitungen zur Fehlerbehebung und Änderungen, die neben dem Kernprotokoll bereitgestellt werden, werden Benutzer dabei unterstützt, den Workflow an ihre Bedürfnisse anzupassen. Die Hinzufügung benutzerfreundlicher bioinformatischer Werkzeuge zum Arbeitsablauf stellt eine wichtige Weiterentwicklung des ursprünglichen Protokolls dar und bietet schnelle und standardisierte Methoden, die von Benutzern mit minimaler bioinformatischer Vorerfahrung angewendet werden können, um Sequenzdaten in lokalen Kontexten zu interpretieren. Die Kapazitäten, dies vor Ort zu tun, sind oft durch die Notwendigkeit begrenzt, über spezifische Programmier- und phylogenetische Fähigkeiten zu verfügen, die eine intensive und langfristige Investition in die Ausbildung von Fähigkeiten erfordern. Während diese Fähigkeiten wichtig sind, um Sequenzdaten gründlich zu interpretieren, sind grundlegende und zugängliche Interpretationswerkzeuge ebenso wünschenswert, um lokale “Sequenzierungs-Champions” zu befähigen, deren Kernkompetenz möglicherweise im Nasslabor liegt und die es ihnen ermöglicht, ihre Daten zu interpretieren und die Verantwortung dafür zu übernehmen.
Da das Protokoll seit einigen Jahren in mehreren Ländern praktiziert wird, können wir nun eine Anleitung zur Optimierung von Multiplex-Primer-Schemata geben, um die Abdeckung zu verbessern und mit der angesammelten Vielfalt umzugehen. Es wurden auch Anstrengungen unternommen, um den Anwendern zu helfen, die Kosteneffizienz zu verbessern oder eine einfache Beschaffung in einer bestimmten Region zu ermöglichen, was in der Regel eine Herausforderung für die Nachhaltigkeit molekularer Ansätze darstellt63. In Afrika (Tansania, Kenia und Nigeria) haben wir uns beispielsweise für einen Blunt/TA-Ligase-Mastermix bei der Adapterligation entschieden, der bei lokalen Lieferanten leichter erhältlich und eine günstigere Alternative zu anderen Ligationsreagenzien darstellte.
Erfahrungsgemäß gibt es mehrere Möglichkeiten, die Kosten pro Probe und pro Lauf zu senken. Die Reduzierung der Anzahl der Proben pro Lauf (z. B. von 24 auf 12 Proben) kann die Lebensdauer von Durchflusszellen über mehrere Läufe verlängern, während eine Erhöhung der Anzahl der Proben pro Lauf die Zeit und die Reagenzien maximiert. In unseren Händen waren wir in der Lage, Durchflusszellen für einen von drei Sequenzierläufen zu waschen und wiederzuverwenden, so dass weitere 55 Proben sequenziert werden konnten. Das Waschen der Durchflusszelle unmittelbar nach dem Gebrauch oder, falls dies nicht möglich ist, das Entfernen der Abfallflüssigkeit aus dem Abfallkanal nach jedem Durchlauf schien die Anzahl der Poren zu erhalten, die für einen zweiten Durchlauf zur Verfügung standen. Unter Berücksichtigung der anfänglichen Anzahl der Poren, die in einer Durchflusszelle verfügbar sind, kann ein Lauf auch optimiert werden, um zu planen, wie viele Proben in einer bestimmten Durchflusszelle ausgeführt werden sollen.
Obwohl der Workflow darauf abzielt, so umfassend wie möglich zu sein, mit zusätzlichen detaillierten Anleitungen und ausgeschilderten Ressourcen, ist das Verfahren immer noch komplex und kann für einen neuen Benutzer entmutigend sein. Der Benutzer wird ermutigt, persönliche Schulungen und Unterstützung in Anspruch zu nehmen, idealerweise vor Ort oder alternativ durch externe Mitarbeiter. Auf den Philippinen beispielsweise hat ein Projekt zum Aufbau von Kapazitäten in regionalen Laboren für die genomische Überwachung von SARS-CoV-2 mittels ONT Kernkompetenzen unter Diagnostikern im Gesundheitswesen entwickelt, die leicht auf die RABV-Sequenzierung übertragbar sind. Wichtige Schritte, wie z. B. die SPRI-Bead-Reinigung, können ohne praktisches Training schwer zu meistern sein, und eine ineffektive Reinigung kann die Durchflusszelle beschädigen und den Lauf beeinträchtigen. Die Kontamination von Proben ist bei der Verarbeitung von Amplikons im Labor immer ein großes Problem und kann schwer zu beseitigen sein. Insbesondere Kreuzkontaminationen zwischen Proben sind in der Bioinformatik nach dem Durchlauf äußerst schwer zu erkennen. Gute Labortechniken und -praktiken, wie z. B. die Aufrechterhaltung sauberer Arbeitsflächen, die Trennung von Pre- und Post-PCR-Bereichen und die Einbeziehung von Negativkontrollen, sind unerlässlich, um die Qualitätskontrolle zu gewährleisten. Das hohe Tempo der Entwicklung der Nanoporen-Sequenzierung ist sowohl ein Vor- als auch ein Nachteil für die routinemäßige RABV-Genomüberwachung. Kontinuierliche Verbesserungen der Genauigkeit, Zugänglichkeit und des Protokollrepertoires von Nanopore erweitern und verbessern den Anwendungsbereich. Dieselben Entwicklungen machen es jedoch schwierig, Standardarbeitsanweisungen und bioinformatische Pipelines aufrechtzuerhalten. In diesem Protokoll stellen wir ein Dokument zur Verfügung, das den Übergang von älteren zu aktuellen Nanoporenbibliotheks-Vorbereitungskits (Materialtabelle) unterstützt.
Ein häufiges Hindernis für die Sequenzierung in LMICs ist die Zugänglichkeit, die nicht nur die Kosten, sondern auch die Möglichkeit der zeitnahen Beschaffung von Verbrauchsmaterialien (insbesondere Sequenzierungsreagenzien, die für Beschaffungsteams und Lieferanten relativ neu sind) und Rechenressourcen sowie einfach den Zugang zu stabiler Stromversorgung und dem Internet umfasst. Die Verwendung der tragbaren Nanoporen-Sequenzierungstechnologie als Grundlage dieses Arbeitsablaufs hilft bei vielen dieser Zugänglichkeitsprobleme, und wir haben die Verwendung unseres Protokolls in einer Reihe von Umgebungen demonstriert, indem wir das vollständige Protokoll und die Analyse vor Ort durchgeführt haben. Zugegebenermaßen ist die rechtzeitige Beschaffung von Geräten und Verbrauchsmaterialien für die Sequenzierung nach wie vor eine Herausforderung, und in vielen Fällen waren wir gezwungen, Reagenzien aus dem Vereinigten Königreich zu transportieren oder zu versenden. In einigen Bereichen konnten wir uns jedoch vollständig auf lokale Lieferwege für Reagenzien verlassen und profitierten von Investitionen in die SARS-CoV-2-Sequenzierung (z. B. auf den Philippinen), die die Beschaffungsprozesse rationalisiert und begonnen haben, die Anwendung der Genomik von Krankheitserregern zu normalisieren.
Der Bedarf an einer stabilen Internetverbindung wird durch einmalige Installationen minimiert. Zum Beispiel benötigen GitHub-Repositories, Software-Downloads und die Nanoporen-Sequenzierung selbst nur einen Internetzugang, um den Lauf zu starten (nicht durchgehend) oder können mit Zustimmung des Unternehmens vollständig offline durchgeführt werden. Wenn mobile Daten verfügbar sind, kann ein Telefon als Hotspot für den Laptop verwendet werden, um den Sequenzierungslauf zu starten, bevor die Verbindung für die Ausführungsdauer getrennt wird. Bei der routinemäßigen Verarbeitung von Proben können die Anforderungen an die Datenspeicherung schnell steigen, und im Idealfall werden die Daten auf einem Server gespeichert. Ansonsten sind SSD-Festplatten (Solid State Drives) relativ kostengünstig zu beschaffen.
Wir sind uns zwar bewusst, dass es immer noch Hindernisse für die genomische Überwachung in LMICs gibt, aber steigende Investitionen in den Aufbau von Zugang und Fachwissen zur Genomik (z. B. Africa Pathogen Genomics Initiative [Africa PGI])64 deuten darauf hin, dass sich diese Situation verbessern wird. Die genomische Überwachung ist für die Pandemievorsorge von entscheidender Bedeutung6, und Kapazitäten können durch die Routineisierung der genomischen Überwachung endemischer Krankheitserreger wie RABV aufgebaut werden. Die globalen Ungleichheiten bei den Sequenzierungskapazitäten, die während der SARS-CoV-2-Pandemie zutage getreten sind, sollten ein Motor für einen katalytischen Wandel sein, um diese strukturellen Ungleichheiten anzugehen.
Dieser Workflow von der Probe über die Sequenz bis zur Interpretation für RABV, einschließlich zugänglicher bioinformatischer Werkzeuge, hat das Potenzial, als Richtschnur für Kontrollmaßnahmen verwendet zu werden, die darauf abzielen, bis 2030 keine Todesfälle beim Menschen durch hundevermittelte Tollwut mehr zu erreichen, und letztendlich für die Eliminierung von RABV-Varianten. In Kombination mit relevanten Metadaten ermöglichen die aus diesem Protokoll generierten genomischen Daten eine schnelle RABV-Charakterisierung bei Ausbruchsuntersuchungen und bei der Identifizierung zirkulierender Abstammungslinien in einem Land oder einer Region60,61,65. Wir veranschaulichen unsere Pipeline hauptsächlich anhand von Beispielen aus der durch Hunde vermittelten Tollwut; Der Workflow ist jedoch direkt auf Wildtier-Tollwut anwendbar. Diese Übertragbarkeit und die niedrigen Kosten minimieren die Herausforderungen bei der einfachen Bereitstellung von Routinesequenzierungen, nicht nur für Tollwut, sondern auch für andere Krankheitserreger46,66,67, um das Krankheitsmanagement und die Krankheitskontrolle zu verbessern.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von Wellcome [207569/Z/17/Z, 224670/Z/21/Z], Newton-Finanzierung durch den Medical Research Council [MR/R025649/1] und das philippinische Ministerium für Wissenschaft und Technologie (DOST), die UK Research and Innovation Global Effort on COVID-19 [MR/V035444/1], den University of Glasgow Institutional Strategic Support Fund [204820], Medical Research Council New Investigator Award (KB) [MR/X002047/1], und International Partnership Development Fund, ein Stipendium des DOST British Council-Philippines (CB), ein GemVi-Stipendium des National Institute for Health Research [17/63/82] und Stipendien der University of Glasgow vom MVLS DTP (KC) [125638-06], dem EPSRC DTP (RD) [EP/T517896/1] und dem Wellcome IIB DTP (HF) [218518/Z/19/Z]. Wir danken den Kollegen und Mitarbeitern, die diese Arbeit unterstützt haben: Daniel Streicker, Alice Broos, Elizabeth Miranda, DVM, Daria Manalo, DVM, Thumbi Mwangi, Kennedy Lushasi, Charles Kayuki, Jude Karlo Bolivar, Jeromir Bondoc, Esteven Balbin, Ronnel Tongohan, Agatha Ukande, Davis Kuchaka, Mumbua Mutunga, Lwitiko Sikana und Anna Czupryna.
Materials
| Brand name | |||
| Software | |||
| Sequencing software (MinKnow) |
Oxford Nanopore Technologies | https://community.nanoporetech.com/downloads | |
| Bioinformatics tool kit (Guppy) |
Oxford Nanopore Technologies | https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018 | |
| Equipment | |||
| Thermal cycler (miniPCR™ mini16 thermal cycler) |
Cambio | MP-QP-1016-01 | |
| Homogenizer (Precellys Evolution Touch Homogenizer) |
Bertin Instruments | EQ02520-300 | |
| Cold Racks (0.2-0.5mL) (PCR Mini-cooler with transparent lid) |
BRAND | 781260 | |
| Pipettor | |||
| (Pipetman L Fixed F1000L, 1000 uL) | Gilson | SKU: FA10030 | |
| (Pipetman L Fixed F100L, 100 uL) | Gilson | SKU: FA10024 | |
| (Pipetman L Fixed F10L, 10 uL) | Gilson | SKU: FA10020 | |
| (Pipetman L Fixed F1L, 1 uL) | Gilson | SKU: FA10025 | |
| (Pipetman L Fixed F20L, 20 uL) | Gilson | SKU: FA10021 | |
| (Pipetman L Fixed F250L, 250 uL) | Gilson | SKU: FA10026 | |
| Fluorometer (Qubit 4 Fluorometer) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q33238 | |
| Laptop (Any brand with ~2 GB of drive space, minimum of 512 GB storage space, msi installer [GPU]) |
|||
| Microcentrifuge (Refrigerated centrifuge) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 75004081 | |
| Vortex mixer (Basic vortex mixer) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 88882011 | |
| Magnetic rack (DynaMag -2 Magnet) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 12321D | |
| Sequencing device (MinION) |
Oxford Nanopore Technologies | MinION Mk1B | |
| RNA Extraction | |||
| RNA extraction kit (Qiagen RNEasy Mini Kit 250) |
Qiagen | 74106 | |
| RNA stabilizing reagents | |||
| (RNA later) | Invitrogen | AM7020 | |
| (DNA/RNA Shield) | Zymo Research | R1100-50 | |
| PCR | |||
| Nuclease-free Water (Nuclease-free Water [not DEPC-treated]) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | AM9937 | |
| Master mix for first strand cDNA synthesis (LunaScript RT SuperMix Kit) |
New England Biolabs | E3010S | |
| DNA amplification master mix (Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix [NEB]) |
New England Biolabs | M0494L | |
| Primer (Scheme) (Custom DNA oligos) |
Invitrogen | ||
| SPRI Bead Clean-up | |||
| SPRI beads (Aline Biosciences PCR Clean DX ) |
Cambio | AL-AC1003-50 | |
| Ethanol, Pure Absolute, >99.8% (GC) [Riedel-De Haen] | Merck | 818760 | |
| Short Fragment buffer (SFB expansion pack) |
Oxford Nanopore Technologies | EXP-SFB001 | |
| DNA Quantification | |||
| DNA quantification kit (Qubit® dsDNA HS Assay Kit) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q32854 | |
| DNA quantification assay tubes (Qubit™ Assay Tubes) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q32856 | |
| End Prep and barcoding (Qubit™ Assay Tubes) |
|||
| End Prep master mix (NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module) |
New England Biolabs | E7546L | |
| Barcoding kit | |||
| *Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 | |
| (Native Barcoding Expansion 1-12) | EXP-NBD104 | ||
| (Native Barcoding Expansion 13-24) | EXP-NBD114 | ||
| (Native Barcoding Expansion 96) | EXP-NBD196 | ||
| *Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 | |
| (not compatible) | (not compatible) | ||
| (Native Barcoding Kit 24 V14) | SQK-NBD114.24 | ||
| (Native Barcoding Kit 96 V14) | SQK-NBD114.96 | ||
| Ligation mastermix (Blunt/TA Ligase Master Mix) |
New England Biolabs | M0367S | |
| Adapter Ligation | |||
| Adapter ligation master mix | |||
| (NEBNext Quick Ligation Module) | New England Biolabs | E6056S | |
| (NEBNext Ultra II Ligation Module) | New England Biolabs | E7595S | |
| (Blunt/TA Ligase Master Mix) | New England Biolabs | M0367S | |
| Adapter mix | |||
| *Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 EXP-AMII001 |
|
| (Adapter Mix II [AMII]) | |||
| *Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 EXP-NBA114 |
|
| (Native adapter [NA]) | |||
| Sequencing | |||
| Flowcell priming kit | |||
| *Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 EXP-FLP002 |
|
| (Flush Buffer [FB]) | |||
| (Flush Tether [FT]) | |||
| *Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 EXP-FLP004 |
|
| (Flow Cell Flush [FCF]) | |||
| (Flow Cell Tether [FCT]) | |||
| Ligation Sequencing Kit | |||
| *Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 SQK-LSK109 |
|
| Adapter Mix (Adapter Mix [AMX]) |
|||
| Ligation Buffer (Ligation buffer [LNB]) |
|||
| Short Fragment Buffer (Short Fragment buffer [SFB]) |
|||
| Sequencing Buffer (Sequencing Buffer [SQB]) |
|||
| Elution Buffer (Elution buffer [EB]) |
|||
| Loading Beads (Loading Beads [LB]) |
|||
| Sequencing Tether (Sequencing Tether [SQT]) |
|||
| *Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 SQK-LSK114 |
|
| Adapter Mix (Ligation Adapter [LA]) |
|||
| Ligation Buffer (Ligation buffer [LNB]) |
|||
| Short Fragment Buffer (Short Fragment buffer [SFB]) |
|||
| Sequencing Buffer (Sequencing Buffer [SB]) |
|||
| Elution Buffer (Elution buffer [EB]) |
|||
| Loading Beads (Loading Beads [LIB]) |
|||
| Sequencing Tether (Flow Cell Tether [FCT]) |
|||
| Library solution (Library solution [LIS]) |
|||
| Flush buffer (Flow Cell Flush [FCF]) |
|||
| Flow Cell | |||
| *Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 FLO-MIN106D |
|
| (Flow Cell [R9.4.1]) | |||
| *Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 FLO-MIN114 |
|
| (Flow Cell [R10.4.1]) | |||
| Flow Cell wash | |||
| Flowcell wash kit (Flow cell wash kit) |
Oxford Nanopore Technologies | EXP-WSH004 | |
| Consummables | |||
| Surface decontaminant | |||
| (DNA Away Surface Decontaminant, Squeeze Bottle [Molecular Bio]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 7010PK | |
| (RNase Away Surface Decontaminant, Bottle [Molecular Bio]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 7002PK | |
| PCR 8-Tube Strip 0.2ml, individual cap (PCR 8-Tube Strip 0.2ml, with Individual attached Flat Caps, Sterile, DNAse/RNAse, Pyrogen Free,Natural [Greiner]) |
Greiner | 608281 | |
| PCR Tube 0.2ml (PCR Tube 0.2ml, Natural [Domed Cap] Bagged in 500s, Non-Sterile [Greiner]) |
Greiner | 671201 | |
| 1000µL Filter Tips (500) (Stacked 1000µL Filter Tips [500]) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11977724 | |
| 100µL Filter Tips (1000) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11947724 | |
| 10µL Filter Tips (1000) (Stacked 100µL Filter Tips [1000]) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11907724 | |
| Reinforced tubes tubes (2ml) with screw caps and o-rings (Fisherbrand™ Bulk tubes) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 15545809 | |
| Microcentrifuge tube (1.5ml) (1.5 ml Eppendorf Tubes [500]) |
Eppendorf | 1229888 | |
| DNA LoBind Tubes (1.5ml) (DNA LoBind Tubes) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 10051232 | |
| Cryobabies labels | |||
| Gloves (S/M/L) | |||
| Paper towel |
References
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