Establecimiento simple de un nicho de médula ósea osteogénica vascularizada utilizando hidrogeles de poli(etilenglicol) (PEG) prefabricados en una microplaca de imágenes

En la figura 1 se resumen las siguientes secciones de protocolo. 1. Establecimiento del monocultivo del estroma 3D Prepare la suspensión de células hBM-MSC.Cultive hBM-MSC a un nivel de confluencia de 70% -90% en MEMα suplementado con 10% FBS, 1% de penicilina-estreptomicina y 5 ng / ml FGF-2 en una incubadora a 37 ° C y 5% deCO2 en una atmósfera humidificada. Las celdas pueden utilizarse hasta el pasaje 6. Lavar las células con PBS y separarlas con tripsina-EDTA al 0,05% durante 3-5 min a 37 °C. Detenga el proceso de desprendimiento lavando con medio basal (MEMα suplementado con 10% FBS y 1% de penicilina-estreptomicina). Recoja las células suspendidas en un tubo de centrífuga cónica de 50 ml. Cuente las células con un hematocitómetro o un contador de células automatizado, y determine el número total de células en la suspensión. Granular las células por centrifugación a 200 x g durante 5 min. Retire con cuidado el sobrenadante. Resuspender las células en un volumen apropiado de medio basal para alcanzar una concentración de 1 x 107 células/ml de solución madre. Prepare tubos de centrífuga cónica de 50 ml que contengan el volumen requerido de medio basal suplementado con los respectivos factores de crecimiento (FGF-2 y BMP-2 a concentraciones definidas, por ejemplo, 0 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml, 100 ng / ml o 200 ng / ml). Por pozo, se requieren 200 μL. Si la siembra de células se va a realizar utilizando un manipulador de líquidos automatizado, considere también el volumen muerto del instrumento. Para la siembra manual de células, un exceso de volumen del 10% es suficiente. Añadir las hBM-MSC de la solución madre con una dilución de 1:66,67 para alcanzar una concentración de 1,5 x 105 células/ml. Prepare el plato para la siembra.Retire la película adhesiva de polipropileno que cubre la placa de hidrogel de 96 pocillos. Aspirar cuidadosamente el tampón de almacenamiento que cubre los hidrogeles. Para esta tarea, use una lavadora de microplacas; sin embargo, la manipulación manual es posible.Cuando use un aspirador manual o una pipeta multicanal, coloque la punta contra la pared del pozo y desplácese lentamente hacia el borde del pozo interior mientras aspira el tampón. Esto evitará dañar la superficie del hidrogel. Cuando utilice una lavadora de placas automatizada, coloque las boquillas de aspiración al menos a 3,8 mm del portador de la placa (esto corresponde a 0,8 mm del anillo interior de la placa de hidrogel) y hacia el borde del pozo. Consulte el manual del fabricante para obtener instrucciones más detalladas y para obtener los dibujos de la placa de hidrogel de 96 pocillos. Añadir 200 μL/pocillo de la suspensión celular preparada en la etapa 1.1.7 después de mezclar bien para asegurarse de que las células están distribuidas homogéneamente. Durante la siembra, para evitar la sedimentación desigual de las células en una región del sustrato, no incline la placa. Para la siembra manual, mezcle periódicamente la suspensión celular (después de sembrar tres pocillos) para mantener la mezcla homogénea. Para la siembra automatizada, mezclar con una pipeta serológica inmediatamente antes de la dispensación para dispensar volúmenes que contengan igual número de células. Mantener los cultivos a 37 °C y 5%CO2 en atmósfera humidificada. Monitorear el desarrollo de los cultivos por microscopía de campo claro con un objetivo 5x según se desee. Adquiera imágenes de referencia aproximadamente 30 minutos después de la siembra para evaluar el número de células agregadas. 2. Establecimiento del cocultivo 3D de células estromales-endoteliales Prepare la suspensión celular GFP-HUVEC.Preparar matraces para el cultivo HUVEC recubriendo con una solución consistente en 150 μg/ml de colágeno I de cola de rata en ácido acético 0,02 M durante 30 min a 37 °C. Enjuague una vez con PBS antes de usar. Cultivar las GFP-HUVEC a un nivel de confluencia del 80%-100% en EGM-2 suplementado con 10% de FBS en una incubadora a 37 °C y 5% deCO2 en una atmósfera humidificada. Las celdas pueden utilizarse hasta el pasaje 7. Lave las células con PBS y sepárelas con tripsina-EDTA al 0,05% durante 2-3 min a 37 °C. Detenga el proceso de desprendimiento lavando con medio basal (MEMα suplementado con 10% FBS y 1% de penicilina-estreptomicina). Recoja las células suspendidas en un tubo de centrífuga cónica de 50 ml. Cuente las células usando un hematocitómetro o un contador celular automatizado, y determine el número total de células presentes en la suspensión. Granular las células por centrifugación a 200 x g durante 5 min. Retire con cuidado el sobrenadante. Resuspender las células en un volumen apropiado de medio basal para alcanzar una concentración de 1 x 107 células/ml de solución madre. Preparar tubos de centrífuga cónicos de 50 ml que contengan el volumen requerido de medio basal suplementado con los respectivos factores de crecimiento (FGF-2 y BMP-2 a concentraciones definidas, por ejemplo, 0 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml o 200 ng/ml) como se describe para las hBM-MSC en el paso 1.1.6. Añadir las GFP-HUVEC de la solución madre a una dilución de 1:66,67 para alcanzar una concentración de 1,5 x 105 células/ml, como se describe para las hBM-MSC en el paso 1.1.7. Aspirar el medio de la placa que contiene el monocultivo del estroma, como se describe para la eliminación del tampón en el paso 1.2.2. Añadir 200 μL/pocillo de la suspensión celular GFP-HUVEC preparada en el paso 2.1.8, tal como se describe para la adición de hBM-MSC en el paso 1.3. Incubar a 37 °C y 5% deCO2 en atmósfera humidificada. Cambie el medio cada 3-4 días. Monitorear el desarrollo del cultivo mediante microscopía de campo claro y fluorescencia utilizando un objetivo 5x según se desee. Mantener los cultivos hasta el día 4 o el día 7 de cocultivo para caracterizaciones tempranas o intermedias, respectivamente, o según se desee. 3. Procedimiento de caracterización 1: Cuantificación de la formación de redes celulares endoteliales En los puntos de tiempo deseados, adquiera la señal GFP de los GFP-HUVEC con microscopía de fluorescencia utilizando ajustes adecuados para la cuantificación (es decir, mejor enfoque, alto contraste y bajo aumento [por ejemplo, 5x] para campos de visión más grandes). Preprocese por igual todas las imágenes adquiridas el mismo día (por ejemplo, usando Fiji32) para mejorar aún más el contraste. Tenga en cuenta que la señal GFP puede atenuarse con el tiempo de cultivo; Por lo tanto, las imágenes adquiridas en diferentes días pueden necesitar un procesamiento diferente.Si usa Fiji o ImageJ, abra todas las imágenes del canal GFP del mismo punto de tiempo y abra el menú Brillo y contraste . Seleccione una imagen que represente una condición intermedia (no la señal más tenue ni la más brillante) y ajuste automáticamente el contraste seleccionando Automático. Seleccione Establecer y marque Propagar a todas las demás imágenes abiertas. Evalúe visualmente si el rango seleccionado automáticamente se ajusta a todas las imágenes del punto de tiempo actual, y vuelva a ajustar y volver a propagar manualmente a todas las imágenes según sea necesario. Guarde las imágenes ajustadas como archivos TIF y repita los pasos 3.2.1 y 3.2.2 para los demás puntos de tiempo adquiridos. Aplique un filtro de desenfoque mediano (por ejemplo, radio 3 para imágenes de 2048×2048) a todas las imágenes para evitar el reconocimiento de artefactos aguas abajo y, por lo tanto, facilitar la identificación precisa de la red. Reduzca el tamaño agrupando (2×2) y guarde todas las imágenes preprocesadas como archivos TIF de color RGB en escala de grises en una carpeta para su cuantificación. Estos pasos se pueden realizar manualmente o en modo por lotes utilizando macros que los autores compartirán a pedido. Analice todas las imágenes de la carpeta creada en los pasos 3.1-3.3 mediante el modo Proceso por lotes del Analizador de angiogénesis para ImageJ33. Tenga en cuenta que, dependiendo del tamaño de las imágenes y la memoria de trabajo disponible, esto puede tardar unos minutos por imagen. Validar los resultados de cuantificación examinando las superposiciones de las estructuras reconocidas y las imágenes originales. Si el algoritmo reconoce estructuras artificiales, donde solo se pueden ver unas pocas o ninguna celda en la imagen original, ajuste los parámetros de preprocesamiento y vuelva a analizar las imágenes originales, o excluya dichas áreas problemáticas y / o replique las imágenes del análisis. Normalizar los valores obtenidos a un área de 1 mm 2 multiplicando los valores de cada muestra por la relación del área analizada a 1 mm2. Este paso es de particular importancia si se utilizan imágenes de diferentes tamaños. Extraiga varios parámetros de red, como la longitud total de la red, el número de uniones, el número de segmentos, el número de segmentos aislados, el intervalo de ramificación y el tamaño medio de la malla, del análisis, y utilícelos para caracterizar la red endotelial en diferentes puntos de tiempo y bajo diferentes condiciones de cultivo. 4. Procedimiento de caracterización 2: Evaluación de la deposición de ECM En los puntos de tiempo finales deseados, evalúe la deposición de ECM utilizando inmunofluorescencia. Añadir anticuerpos primarios contra varias moléculas de ECM en 100 μL del medio de cultivo durante las últimas 6 h de cultivo o después de la fijación, como se describe a continuación.Lave los cultivos una vez con 200 μL/pocillo de PBS durante 5 min a RT, y fíjelos con 100 μL/pocillo de paraformaldehído al 4% bajo una campana extractora de humos químicos durante 30 min a RT. Tenga en cuenta que se recomienda fijar todos los pocillos de una placa al mismo tiempo, ya que los cultivos circundantes pueden dañarse durante este paso. Lavar los cultivos fijos con 200 μL/pocillo de PBS a RT tres veces durante 5 min cada vez, y almacenar a 4 °C en 200 μL/pocillo de PBS, o proceder inmediatamente al siguiente paso. Antes de incubar con anticuerpos primarios contra moléculas de ECM después de la fijación, incubar los cultivos fijos con 200 μL/pocillo de BSA al 1% en PBS como solución bloqueante durante 30 min a RT.Aspirar la solución de bloqueo e incubar con 100 μL/pocillo de la solución de anticuerpos primarios en BSA al 1% en PBS durante la noche a 4 °C. Lavar con 200 μL/pocillo de PBS tres veces durante 5 min, al menos 3 h y 5 min, respectivamente, a RT.NOTA: El paso de lavado largo es necesario para la difusión completa del anticuerpo no unido fuera del hidrogel. Para facilitar la penetración de la solución de tinción secundaria, incluyendo contratinciones intracelulares, permeabilizar los cultivos utilizando Triton X-100 al 0,3% y BSA al 1% en PBS durante 30-90 min en RT, dependiendo de la densidad celular de los cultivos.NOTA: Para la tinción basada en anticuerpos de moléculas intracelulares, este paso debe realizarse antes de la incubación con el anticuerpo primario descrito en el paso 4.1.2. Prepare soluciones de tinción secundaria que contengan los respectivos anticuerpos secundarios y contratinciones según desee (por ejemplo, una tinción nuclear como DAPI y una tinción citoesquelética como faloidina-rodamina).Prepare un tampón de tinción que consista en 0.1% de Triton X-100, 1% de BSA en PBS y contratinciones (por ejemplo, 1 μg / ml de DAPI y 1: 4,000 faloidina-rodamina), y agregue los anticuerpos secundarios respectivos en las diluciones recomendadas. Añadir 100 μL/pocillo de solución de tinción secundaria e incubar durante la noche a 4 °C. Similar al procedimiento después de la incubación primaria de anticuerpos, lavar con 200 μL/pocillo de PBS tres veces durante 5 min, al menos 3 h y 5 min, respectivamente, a RT. Para la resolución 3D de las estructuras, adquiera pilas confocales comenzando en el fondo de vidrio con un paso z de 2,5 μm que alcanza una altura final de 500 μm, use un objetivo de 10x y un zoom digital de 0,75x. Para generar una reconstrucción 3D de la señal GFP y F-actin en Fiji, establezca un umbral de cada canal por separado antes de crear un compuesto y generar la reconstrucción utilizando Fiji 3D Viewer. Para la visualización de la ECM depositada a partir de las inmunotinciones, adquiera pilas confocales de una altura de 100 μm con un paso z de 5 μm, un objetivo de 10x y un zoom digital de 1.5x. Genere proyecciones de máxima intensidad y ajuste el brillo y el contraste de cada canal por separado en Fiji antes de crear un compuesto. Realizar tinciones directas de color del ambiente extracelular.Añadir 200 μL/pocillo de solución de tinción de rojo de Picrosirius a los pocillos fijados en paraformaldehído e incubar durante 1 h a RT. Luego, lave los pocillos manchados cinco veces con agua destilada, seguido de lavar dos veces al día o cada dos días durante 3-4 días mientras monitorea la limpieza del color de la muestra. Mantener las placas a 4 °C durante los largos pasos de lavado (es decir, cualquier cosa que exceda las 6 h). Adquiera imágenes de las muestras teñidas utilizando un microscopio de campo brillante equipado con una cámara a color y mantenga un balance de blancos igual en todas las condiciones. Para obtener una visión general de las muestras, use un aumento bajo (por ejemplo, 2.5x) para escanear todo el pozo. Si el microscopio no viene con un software que admita la costura automática, hágalo manualmente (por ejemplo, usando Pairwise Stitching en Fiji34).NOTA: Los pocillos utilizados anteriormente para la inmunofluorescencia se pueden utilizar para esto, siempre que se complete la adquisición de imágenes de fluorescencia. Siga los mismos pasos descritos para la tinción de Picrosirius Red en los pasos 4.2.1-4.2.3 para realizar la tinción, el lavado y la obtención de imágenes de Alizarin Red. 5. Procedimiento de caracterización 3: Evaluación de la diferenciación osteogénica mediante la monitorización de la actividad de la fosfatasa alcalina En diferentes puntos finales del cultivo (p. ej., día 4 y día 7 de cocultivo), evalúe cuantitativamente la actividad de la fosfatasa alcalina mediante el uso de tinción con 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP)/nitro azul tetrazolio (NBT).Lavar los cultivos una vez con 200 μL/pocillo de PBS antes de incubar con la solución de sustrato BCIP/NBT, que debe prepararse siguiendo las instrucciones del fabricante. Incubar a 37 °C mientras monitorea periódicamente el desarrollo del color. Una vez que el color comience a desarrollarse en condiciones no osteogénicas, lavar inmediatamente una vez con 200 μL/pocillo de PBS antes de fijarlo con paraformaldehído al 4%, como se describe en el paso 4.1.1. Adquiera imágenes en color de las muestras teñidas, como se describe en el paso 4.2.3 para la tinción de rojo Picrosirius. En diferentes puntos finales del cultivo (p. ej., día 4 y día 7 de cocultivo), cuantifique la actividad de ALP en los lisados celulares.Lavar los cultivos tres veces con 200 μL/pocillo de PBS antes de incubar con 200 μL/pocillo de tripsina-EDTA al 0,25% a 37 °C. Cada 10 minutos, agite los cultivos pipeteando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo para facilitar la digestión, y controle la morfología del cultivo con un microscopio de cultivo celular estándar. Una vez que se obtiene una suspensión líquida de una sola célula sin estructuras celulares alargadas en los pocillos (generalmente después de 20-30 min), transfiera las muestras a tubos de 2 ml, agregue 200 μL de medio basal MSC para inhibir la tripsina y centrifugue a 500 x g durante 5 minutos para granular las células recuperadas. Decantar el sobrenadante y congelar los gránulos a −80 °C, o continuar directamente al paso 5.2.3. Descongelar los gránulos celulares obtenidos en la etapa 5.2.2, e incubar con 500 μL de tampón de lisis compuesto por 0,56 M 2-Amino-2-metil-1-propanol, 0,2% Triton X-100, pH 10, durante 30 min en hielo. A continuación, centrifugar a 16.100 x g durante 10 min a 4 °C, y mantener las muestras en hielo. Después de las mediciones descritas en el paso 5.2.7, congelar las muestras a −20 °C o −80 °C, o continuar directamente con la cuantificación del ADN, como se describe en el paso 5.2.8.NOTA: El tampón de lisis puede prepararse de antemano, filtrarse estérilmente y almacenarse a 4 °C. Preparar el reactivo ALP constituido por 20 mM de sal disódica de 4-nitrofenil fosfato hexahidratado y 4 mM de MgCl2 en tampón de lisis.NOTA: Es mejor preparar esta solución fresca el día de la cuantificación. Sin perturbar ningún residuo granulado, dispensar 50 μL del sobrenadante de lisado celular preparado en el paso 5.2.3 en los pocillos de una placa estándar transparente de 96 pocillos en duplicados. Agregue búfer de lisis a dos pocillos como controles en blanco. Con una pipeta multicanal, añadir 50 μL/pocillo de reactivo ALP a los pocillos llenados en el paso 5.2.5. Agitar brevemente el plato e incubar a 37 °C durante 10 min protegido de la luz. Los pozos con mayor actividad ALP aparecerán amarillos. Detener la reacción añadiendo 100 μL/pocillo de NaOH 1 M utilizando una pipeta multicanal. Lea la densidad óptica a 410 nm utilizando un lector de placas. Promedie los duplicados técnicos y reste el promedio de los controles en blanco. Realizar la cuantificación del ADN para normalizar la actividad ALP determinada en los pasos anteriores contra el número total de células. Aquí se describe un método basado en mediciones de fluorescencia, pero cualquier otro método para la cuantificación del ADN en lisados celulares es compatible con el ensayo. Preparar los reactivos y los estándares de ADN necesarios para la cuantificación del ADN utilizando kits disponibles comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.NOTA: Se recomienda utilizar tampón de lisis para preparar los estándares de ADN. Si las muestras utilizadas para la cuantificación de la fosfatasa alcalina descritas en el paso 5.2.3 se congelaron, descongelarlas, centrifugarlas a 16.100 x g durante 2 min a 4 °C y colocarlas en hielo. Sin perturbar ningún residuo granulado, dispensar 50 μL del sobrenadante de lisado celular en los pocillos de una placa negra de 96 pocillos por duplicado. Congelar las muestras a -20 °C o -80 °C, y repetir las cuantificaciones de ALP y ADN si es necesario. Agregue los estándares de ADN por duplicado. Con una pipeta multicanal, agregue 50 μL del agente de tinción de ADN, incube y lea la intensidad de fluorescencia según las instrucciones del fabricante. Utilizando los valores de la curva estándar, determine y aplique la conversión de los valores de intensidad medidos a las concentraciones de ADN. Normalizar los valores de ALP obtenidos en el paso 5.2.7 dividiéndolos por la respectiva concentración de ADN de cada muestra. 6. Aplicación 1: Realización de ensayos de sensibilidad a los medicamentos Cuando las redes endoteliales estén completamente desarrolladas (típicamente en el día 4 de los cocultivos de células estromales-endoteliales), agregue compuestos antiangiogénicos, como bevacizumab, a los cultivos en un medio de cultivo fresco y pruebe su actividad a lo largo del tiempo y bajo diferentes condiciones (por ejemplo, diferentes concentraciones de FGF-2 o BMP-2).Preparar un medio de cultivo fresco que contenga los mismos factores de crecimiento utilizados para los cultivos respectivos hasta ese momento.Prepare una solución de control que consista en el diluyente del compuesto de interés (p. ej., para bevacizumab: 60 mg/ml de α-trehalosa dihidrato, 0,4 mg/ml de Tween20, 5,8 mg/ml de fosfato de sodio, monobásico y monohidrato, y 1,2 mg/ml de fosfato de sodio dibásico, anhidro), y filtrarlo estérilmente. Añadir el compuesto de interés a la concentración deseada (p. ej., 10 μg/ml de bevacizumab) y un volumen igual de la solución de control al medio de cultivo designado para las condiciones de ensayo y control, respectivamente. Aspirar el medio del cultivo y añadir 200 μL/pocillo del medio recién preparado en la etapa 6.1.1. Incubar durante un tiempo apropiado para el compuesto a probar (p. ej., para bevacizumab: 2 días). Monitorizar el desarrollo del cultivo y caracterizar las redes endoteliales como se describe en la sección 3. Evaluar la eficacia del compuesto para inhibir la angiogénesis o ablacionar las estructuras preformadas utilizando las imágenes GFP y los parámetros cuantitativos de red extraídos del análisis descrito en el paso 3.7. 7. Aplicación 2: Establecimiento de sistemas avanzados de cocultivo con varios tipos de células cancerosas En el día 4 del cocultivo, cuando las redes endoteliales están casi establecidas, agregue otros tipos de células, como MDA-MB-231 o células cancerosas U2OS, a los cultivos en medio de cultivo fresco.Etiquete las células cancerosas utilizando un tinte vivo compatible con las células según las instrucciones del fabricante para poder distinguirlas de los HUVEC marcados con GFP y los hBM-MSC no marcados en los cocultivos. Preparar una suspensión de células cancerosas a una concentración de 1,5 x 104 células/ml en un medio de cultivo fresco que contenga los mismos factores de crecimiento utilizados para los cultivos respectivos hasta ese momento. Monitorear el desarrollo del cultivo y la localización de células cancerosas según se desee.NOTA: Dependiendo del tipo, la actividad y el entorno del cáncer, puede tomar algunos días para que lleguen a las estructuras vasculares en los cocultivos de células estromales-endoteliales (por ejemplo, 2 días para MDA-BM-231 y U2OS). Por lo tanto, las imágenes de lapso de tiempo para visualizar las interacciones cáncer-células vasculares deben cronometrarse en consecuencia.