Ein In-vitro-Modell der Gefäßnische des Knochenmarks wird erstellt, indem mesenchymale und endotheliale Zellen auf vorgegossene 3D-PEG-Hydrogele gesät werden. Die endothelialen Netzwerke, die EZM-Komponenten und die ALP-Aktivität der Nischen variieren je nach verwendetem Wachstumsfaktor. Die Plattform kann für fortgeschrittene Krebsmodelle verwendet werden.
Der Knochen und das Knochenmark sind stark vaskularisierte und strukturell komplexe Organe und Orte für Krebs- und Metastasenbildung. In-vitro-Modelle , die knochen- und knochenmarkspezifische Funktionen, einschließlich der Vaskularisierung, rekapitulieren, die mit dem Wirkstoffscreening kompatibel sind, sind sehr wünschenswert. Solche Modelle können die Lücke zwischen einfachen, strukturell irrelevanten zweidimensionalen (2D) In-vitro-Modellen und den teureren, ethisch anspruchsvollen In-vivo-Modellen schließen. Dieser Artikel beschreibt einen kontrollierbaren dreidimensionalen (3D) Co-Kultur-Assay auf Basis von technisch hergestellten Poly(ethylenglykol) (PEG)-Matrizen zur Erzeugung vaskularisierter, osteogener Knochenmarknischen. Das PEG-Matrix-Design ermöglicht die Entwicklung von 3D-Zellkulturen durch einen einfachen Zellaussaatschritt, der keine Verkapselung erfordert, und ermöglicht so die Entwicklung komplexer Co-Kultursysteme. Darüber hinaus sind die Matrizen transparent und auf 96-Well-Speicherfolien mit Glasboden vorgegossen, wodurch das System für die Mikroskopie geeignet ist. Für den hier beschriebenen Assay werden zunächst humane mesenchymale Stromazellen (hBM-MSCs) aus dem Knochenmark kultiviert, bis sich ein ausreichend entwickeltes 3D-Zellnetzwerk gebildet hat. Anschließend werden GFP-exprimierende humane Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) hinzugefügt. Auf die Kulturentwicklung folgt die Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie. Das Vorhandensein des hBM-MSC-Netzwerks unterstützt die Bildung von gefäßähnlichen Strukturen, die sich sonst nicht bilden würden und die mindestens 7 Tage lang stabil bleiben. Das Ausmaß der vaskulären Netzwerkbildung lässt sich leicht quantifizieren. Dieses Modell kann auf eine osteogene Knochenmarksnische abgestimmt werden, indem das Nährmedium mit dem knochenmorphogenetischen Protein 2 (BMP-2) ergänzt wird, das die osteogene Differenzierung der hBM-MSCs fördert, was durch eine erhöhte Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) an Tag 4 und Tag 7 der Kokultur beurteilt wird. Dieses zelluläre Modell kann als Plattform genutzt werden, um verschiedene Krebszellen zu kultivieren und zu untersuchen, wie sie mit knochen- und knochenmarkspezifischen Gefäßnischen interagieren. Darüber hinaus eignet es sich für die Automatisierung und High-Content-Analysen, was bedeutet, dass es das Screening von Krebsmedikamenten unter hochreproduzierbaren Kulturbedingungen ermöglichen würde.
Der Knochen und das Knochenmark sind strukturell und funktionell komplexe Organe, die für die menschliche Gesundheit von zentraler Bedeutung sind. Dies spiegelt sich in der Existenz unterschiedlicher Nischen wider, die die Hämatopoese und den Knochenerhalt regulieren1. Es ist heute allgemein anerkannt, dass im gesunden Knochenmark der Erhalt und die Expansion von hämatopoetischen und skelettalen Stammzellen sowie ihrer Nachkommen durch bestimmte Nischen gesteuert werden. Diese Nischen umfassen verschiedene Zelltypen, darunter Osteolinienzellen, mesenchymale Stammzellen, Endothel- und Perivaskulärzellen, neuronale und Gliazellen, Adipozyten, Osteoklasten, Makrophagen und Neutrophile2. Es überrascht nicht, dass diese meist mit Gefäßen assoziierten Nischen auch an der Entstehung verschiedener Arten von Leukämie beteiligtsind 3 und der Ort der Metastasierung für verschiedene Krebsarten sind4. Aufgrund seiner spezifischen Rolle bei der Knochenbildung, dem Umbau und der Erhaltung des Knochenmarks (Knochenmarks) weist das knochenassoziierte Gefäßsystem ausgeprägte spezialisierte Strukturen auf, die sich von den Gefäßen unterscheiden, die anderswo im Körper zu finden sind 5,6,7. Daher können anti-angiogene oder gefäßmodulierende Medikamente, die systemisch angewendet werden, in diesen spezialisiertenUmgebungen unterschiedliche Wirkungen haben 8. Daher sind Modelle zur Untersuchung der molekularen Mechanismen, die an der Aufrechterhaltung der physiologischen Eigenschaften des Knochens und des Knochenmarks, der Regeneration von Knochen und Knochenmark und dem Ansprechen auf therapeutische Behandlungen beteiligt sind, sehr wünschenswert.
Klassische zweidimensionale (2D) Gewebekulturen und In-vivo-Untersuchungen an Tiermodellen haben unschätzbare Einblicke in die Rolle verschiedener Zellen und molekularer Akteure gegeben, die an der Entwicklung von Knochen und Knochenmark beteiligt sind 9,10. Modelle, die Hochdurchsatzexperimente mit relevanten menschlichen Zellen ermöglichen, könnten unser Verständnis dafür verbessern, wie ausgewählte Parameter in diesen hochkomplexen Systemen moduliert werden können.
In den letzten zehn Jahren wurden aus dem Tissue Engineering abgeleitete Prinzipien zur Erstellung von 3D-Gewebemodellen eingesetzt11,12. Diese beruhten meist auf der Verkapselung geweberelevanter Zellen in Biomaterialien, um 3D-Mono- oder Co-Kulturen zu etablieren13. Zu den am häufigsten verwendeten Biomaterialien gehören Fibrin14, Kollagen 15 und Matrigel16,17, die alle hochgradig biokompatibel sind und geeignete Bedingungen für das Wachstum vieler Zelltypen bieten. Diese Biomaterialien sind in der Lage, In-vitro-Modelle zu generieren, die Schlüsselaspekte der verschiedenen vaskulären Nischen in vivo rekapitulieren 18. Darüber hinaus hat die Verwendung von mikrofluidischen Geräten zur Erzeugung von perfundierten vaskulären Knochen- und Knochenmarkmodellen zur Erzeugung von In-vitro-Modellen höherer Komplexität beigetragen 19,20,21,22.
Die Schwierigkeit, die Zusammensetzung zu kontrollieren und die Eigenschaften natürlich vorkommender Biomaterialien zu beeinflussen, hat die Entwicklung synthetischer Analoga inspiriert, die rational mit vorhersagbaren physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften entworfen werden können23,24. Wir haben vollsynthetische, mit Faktor XIII (FXIII) vernetzte Hydrogele auf Basis von Poly(ethylenglykol) (PEG) entwickelt, die mit RGD-Peptiden und Matrix-Metalloproteasen (MMP)-Spaltstellen funktionalisiert sind, um die Zellanhaftung und den Zellumbau zu erleichtern25,26. Der modulare Aufbau dieser Biomaterialien wurde erfolgreich eingesetzt, um die Bedingungen für die Bildung von 3D-vaskularisiertem Knochen und Knochenmarkmodellen zu optimieren27,28.
Für die Erprobung einer größeren Anzahl unterschiedlicher Kulturbedingungen und neuer Therapeutika werden Modelle mit einer höheren Durchsatzfähigkeit benötigt. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die FXIII-Vernetzung unseres PEG-Hydrogels durch einen elektrochemischen Prozess so gesteuert werden kann, dass ein tiefer Hydrogel-Steifigkeitsgradient gebildet wird29. Wenn Zellen auf solche Hydrogele aufgesetzt werden, wandern sie ins Innere und entwickeln sich allmählich zu hochgradig vernetzten zellulären3D-Netzwerken 30. Der Wegfall der Verkapselung von Zellen in das Hydrogel, die normalerweise bei anderen 3D-Gerüsten vorhanden ist, vereinfacht nicht nur das experimentelle Design, sondern ermöglicht auch die sequentielle Zugabe verschiedener Zelltypen zu verschiedenen Zeitpunkten, um komplexe Co-Kultursysteme zu erzeugen. Diese Hydrogele sind vorgegossen auf 96-Well-Speicherfolien mit Glasboden erhältlich, wodurch die Etablierung von 3D-Kulturen sowohl durch manuelle als auch durch automatisierte Zellaussaatprotokolle möglich ist. Die optische Transparenz der PEG-Hydrogele macht die Plattform mit der Mikroskopie kompatibel.
Hier stellen wir eine einfache Methode zur Generierung und Charakterisierung vaskularisierter osteogener Nischen innerhalb dieser gebrauchsfertigen, synthetischen Plug-and-Play-Plattform vor. Wir zeigen, dass die Entwicklung vaskulärer Netzwerke mit einem Wachstumsfaktor stimuliert werden kann, der üblicherweise zur Induktion der in vitro Osteogenese verwendet wird, dem knochenmorphogenetischen Protein-2 (BMP-2), während die osteogene Differenzierung durch die Supplementierung von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF-2) verhindert werden kann27,31. Die gebildeten Netzwerke unterscheiden sich im Vergleich zu FGF-2-stimulierten Netzwerken in Bezug auf das Gesamterscheinungsbild sowie die Zell- und EZM-Verteilung. Darüber hinaus wurde die osteogene Induktion mit Hilfe der alkalischen Phosphatase als Marker überwacht. Wir demonstrieren die erhöhte Expression dieses Markers über die Zeit und vergleichen die Expression mit der in FGF-2-stimulierten Netzwerken mit qualitativen und quantitativen Methoden. Abschließend zeigen wir die Eignung der generierten Nischen dieses Modells für zwei potentielle Anwendungen. Zunächst führten wir einen Proof-of-Concept-Test zur Arzneimittelsensitivität durch, indem wir Bevacizumab zu vorgeformten Nischen hinzufügten und den Abbau der vaskulären Netzwerke in seiner Gegenwart überwachten. Zweitens fügten wir MDA-MB-231 Brustkrebs- und U2OS-Osteosarkomzellen zu vorgeformten osteogenen Nischen hinzu, was zeigt, dass die Nischen genutzt werden können, um Interaktionen zwischen Krebszellen und ihrer Umgebung zu untersuchen.
In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Etablierung eines in vitro Modells von stark vaskularisiertem Knochen und Knochenmarksnischen in einer vollsynthetischen und kontrollierbaren 3D-PEG-basierten Matrix, das eine Vielzahl von Anwendungen in der Knochen- und Knochenmarksbiologie, im Tissue Engineering und in der Krebsforschung hat. Dieses Modell baut auf einem synthetischen Hydrogel auf PEG-Basis auf, das mit RGD-Peptiden und MMP-Spaltstellen funktionalisiert und mit einem tiefen Dichtegradienten auf 96-Well-Speicherfolien mit Glasboden gegossen wird30. Es wurde gezeigt, dass diese Plug-and-Play-Plattform den Aufbau hochgradig vernetzter 3D-Mobilfunknetze ermöglicht, ohne dass Zellen in das Hydrogel eingekapselt werden müssen. Ähnlich wie bei dem zuvor beschriebenen Zellverkapselungsprotokoll zeigen wir in dieser Arbeit den Umbau des Substrats durch eine zellinhärente ECM28 , um eine zelltypspezifische Mikroumgebung zu schaffen. So können mit dieser Methode Arzneimittel-Screening-Assays und High-Content-Analysen unter hochreproduzierbaren, organotypischen 3D-Kulturbedingungen einfach durchgeführt werden. Die 96-Well-Platten mit Glasboden und die optisch transparenten Hydrogele machen die Plattform kompatibel mit der Automatisierung des Liquid Handling und der Hochdurchsatzmikroskopie.
Der erste Schritt zur Erzeugung einer osteogenen vaskulären Knochenmarksnische ist die Vorkultur von hBM-MSCs auf dem PEG-Hydrogel für mindestens 3 Tage. Während dieser Zeit lagern sie sich an das Hydrogel an, dringen in es ein und beginnen mit dem Aufbau von Zell-Zell-Kontakten und der ECM-Abscheidung. Vor der Aussaat der hBM-MSCs muss der Speicherpuffer entfernt werden. Da sich das Hydrogel in einer inneren Vertiefung innerhalb der Standardvertiefung der 96-Well-Belichtungsplatte befindet, ist es sicher, die Aspirationsspitze an der Seite der Vertiefung einzuführen, bis sie den inneren Vertiefungsring berührt. Eine Vakuumpumpe kann zur Absaugung verwendet werden, wenn sie auf eine möglichst geringe Saugkraft eingestellt ist. Alternativ kann eine automatische Plattenwaschanlage mit einer auf mindestens 0,8 mm eingestellten Düsenhöhe über dem inneren Wellring verwendet werden, um den Puffer von der Hydrogelplatte abzusaugen. Durch den Einsatz von Automatisierung für das Liquid Handling kann die Beschädigung der Hydrogeloberfläche minimiert und eine höhere Reproduzierbarkeit der resultierenden Kulturen erreicht werden. Kleine Defekte auf der Hydrogeloberfläche werden sichtbar, sobald sich die Zellen auf dem Hydrogel absetzen, und erscheinen in defekten Hydrogelbereichen auf einer niedrigeren Fokusebene. Daher dient die Aufnahme von Referenzbildern an Tag 0 als gute Qualitätskontrolle für die Homogenität der Zellaussaat und die Integrität der Hydrogeloberfläche. Während kleine Hydrogel-Oberflächendefekte die weitere Verwendung des Wells nicht ausschließen, neigen die Zellen dazu, sich an den defekten Stellen zu bündeln und zu nicht repräsentativen Mustern zu wachsen oder schneller das untere Glas zu erreichen, wo sie zu einer Monoschicht heranwachsen. Diese Artefakte müssen bei der Nutzung/Auswertung dieser Bohrungen beachtet werden. Ähnliche Überlegungen gelten für alle Mediumsänderungen, die während der gesamten Dauer des Assays durchgeführt werden.
Der zweite Schritt des Protokolls beinhaltet die Zugabe von GFP-HUVECs zur vorgeformten hBM-MSC-Monokultur (Tag 0 der Kokultur). Die von der hBM-MSC abgeschiedene EZM bietet ein großartiges Gerüst für das Wachstum von Endothelzellen, die in dieser Arbeit selbst in Gegenwart von hBM-MSC-konditioniertem Medium nur runde Zellcluster auf den Hydrogelen bilden konnten (nicht gezeigt). Nach der Aussaat auf den hBM-MSC-Kulturen integrieren sich die HUVECs und bilden mikrogefäßartige Strukturen, die mit denen vergleichbar sind, die in Kokulturen beobachtet werden, die durch Zellverkapselung erzeugt werden27,28. Typischerweise bilden sich innerhalb von 4 Tagen nach der Kokultur gut entwickelte mikrovaskuläre 3D-Netzwerke, die durch die Verwendung von GFP-markierten HUVECs longitudinal überwacht werden können. Diese Strukturen können mindestens 7 Tage lang in Kultur erhalten bleiben, was bedeutet, dass genügend Zeit bleibt, um Veränderungen in der Organisation des Gefäßnetzwerks als Reaktion auf Behandlungen, z. B. für das Screening von antiangiogenen Medikamenten, zu verfolgen. Die morphologischen Elemente des Endothelnetzwerks können im Batch-Modus quantifiziert werden, indem die GFP-Bilder mit etablierten Werkzeugen, wie dem Angiogenesis Analyzer-Plugin von ImageJ33, segmentiert werden, und ihre Parameter können verwendet werden, um beispielsweise die Wirksamkeit und Pharmakodynamik von Medikamenten zu bewerten.
Ein wesentlicher Vorteil des beschriebenen zellulären Modells für viele mögliche Anwendungen ist seine Plastizität. Allein die Ergänzung des Nährmediums mit verschiedenen Wachstumsfaktoren kann das Erscheinungsbild der Co-Kultur verändern. Zum Beispiel schafft die Anwesenheit von BMP-2 während der Mono- und Co-Kulturperiode eine osteogene vaskuläre Nische, die eine erhöhte ALP-Aktivität, extrazelluläre Kalziumablagerung sowie ECM-Assemblierung und -Ablagerung zeigt. Im Gegenteil, in Gegenwart von FGF-2 fehlen die osteogenen Marker, und die Co-Kultur bildet weniger laterale Zellverbände, zeigt aber ein ausgeprägteres 3D-Zellwachstum. Die Tatsache, dass FGF-2 die ALP-Aktivität unterdrückt, während BMP-2 im Vergleich zu keiner Behandlung mit Wachstumsfaktoren eine stärkere ALP-Aktivität hervorruft, stimmt mit früheren Beobachtungen überein27. Trotz dieser großen Unterschiede in der hBM-MSC-Stromakomponente war das Ausmaß des mikrovaskulären Netzwerks für die beiden mit Wachstumsfaktoren behandelten Erkrankungen in dieser Arbeit sehr ähnlich. In den Kontrollkulturen bildeten sich nur wenige kurze Gefäßnetzwerke, die möglicherweise eine schlecht vaskularisierte Knochenmarksnische darstellen. Dies deutet darauf hin, dass durch einfache Änderung der Art, der Konzentration und des Zeitpunkts der Wachstumsfaktoren, die dem Nährmedium zugesetzt werden, eine Reihe von gut definierten vaskularisierten Knochenmarknischen erzeugt werden könnte, wie sie für vergleichende Studien erforderlich wären. Um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten, ist es jedoch wichtig zu beachten, dass der Kulturverlauf und die Morphologie je nach Vorgeschichte der verwendeten Zellen variieren können (z. B. die Anzahl der Passagen und die Ablösungsmethode, die bei der routinemäßigen Kulturpflege verwendet wird), und es ist ratsam, solche Faktoren während des Assay-Designs zu kontrollieren.
Hier demonstrieren wir als erste Anwendung dieses Modells die Sensitivität der konstruierten mikrovaskulären Netzwerke gegenüber der Behandlung mit 10 μg/ml Bevacizumab. Insbesondere ist es wichtig zu bestätigen, dass der verwendete Algorithmus das Endothelnetzwerk genau erkennen kann, da Artefakte oft in Bildern mit schlecht entwickelten Netzwerken erzeugt werden. Wenn dies der Fall ist, müssen die für die Bildverarbeitung verwendeten Parameter (vor und während der Segmentierung) fein abgestimmt werden, oft nach dem Prinzip von Versuch und Irrtum.
Als zweite Anwendung präsentieren wir ein fortschrittliches Co-Kulturmodell, das durch die sequentielle Aussaat von mesenchymalen, endothelialen und Krebszellen gebildet wird. Dieses Modell ermöglicht es, die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen, dem Stroma und dem Gefäßsystem des Knochenmarks zu untersuchen, die wichtige Faktoren während der Metastasierung sein können. Darüber hinaus könnte dieses Modell für das Screening von Medikamenten und zum Testen von Wirkstoffen verwendet werden, deren Ziele über die Angiogenese hinausgehen.
In 2D-Kulturen erhalten Zellen keine physiologischen Mikroumgebungssignale, erwerben keine natürlich vorkommenden Zellmorphologien und differenzieren sich daher anders als Zellen in nativen 3D-Umgebungen35. Wenn die Zellen in technisch hergestellten 3D-Hydrogelen gezüchtet werden, lagern sie frühzeitig eine inhärente EZM ab, die Adhäsionsstellen bietet und aktiv umgestaltet werden kann28,36. Um ein vereinfachtes 3D-Modell für Screening-Anwendungen zu erstellen, wurden gefäßbildende Zellen auf die Oberfläche von künstlich hergestellten Hydrogelen gesät und in der Lage sein, Gefäßnetzwerke ohne Perfusion aufzubauen. Die bildgebenden Auswertungen wurden an 2D-Projektionen der Endothelzellen durchgeführt, die zu vaskulären Strukturen beitragen. Allerdings zeigten nur konfokale Aufnahmen das weniger ausgeprägte Einwachsen der 3D-Gefäßnetzwerke in den BMP-2-stimulierten Proben im Vergleich zu den FGF-2-stimulierten Proben. Dies deutet darauf hin, dass die Länge der gebildeten Gefäßstrukturen unterschätzt wurde, während ihre Konnektivität überschätzt wurde. Darüber hinaus wurden die Wechselwirkungen zwischen perivaskulären und endothelialen Zellen und der vaskulären Lumenbildung nicht untersucht. Diese Aspekte, insbesondere im Hinblick auf das Ansprechen auf die medikamentöse Behandlung, müssen weiter beachtet werden. Schließlich wären verfeinerte Protokolle wünschenswert, um zunächst umfangreiche 3D-Gefäßnetzwerke zu etablieren und erst dann deren osteogene Differenzierung zu induzieren, um physiologischere Knochen- und Knochenmarkmodelle zu generieren.
Insgesamt ist das hier vorgestellte Modell sehr vielseitig und kann leicht auf bestimmte Anwendungen zugeschnitten werden. Zum Beispiel könnten mesenchymale und endotheliale Zellen aus unterschiedlichen Quellen verwendet werden. Es ist bekannt, dass Fettgewebs-MSCs und Nabelschnur-MSCs im Vergleich zu BM-MSCs unterschiedliche angiogene Faktoren exprimieren und leicht als alternative Stromakomponente substituiert werden können37. Anstelle von HUVECs könnten auch Endothelzellen verwendet werden, die aus bereits definierten Knochenmarknischen isoliert wurden. Man könnte die Co-Kultur auch mit patientenbezogenen, passenden mesenchymalen und endothelialen Knochenmarkszellen für Anwendungen in der personalisierten Medizin etablieren, wie es kürzlich für vaskularisierte Muskel-Co-Kulturen vorgeschlagen wurde38. Darüber hinaus ermöglicht das Design der Hydrogelplatte die longitudinale Überwachung der Kultur sowohl mit Hellfeld- als auch mit Fluoreszenzmikroskopie und bietet dem Anwender somit die Möglichkeit, die Kulturzeit je nach Anwendung zu verkürzen oder zu verlängern. Alternativ könnten die Zelldichten, die für die Aussaat verwendet werden, entsprechend angepasst werden, um die Bildung des Zellnetzwerks zu beschleunigen oder zu verzögern, wenn kürzere oder längere Beobachtungszeiten als die in diesem Protokoll vorgesehenen erforderlich sind. In jedem Fall ist Vorsicht geboten, um ein Überwachsen der Zellen zu schichtartigen Strukturen zu vermeiden, was zur Kontraktion des Hydrogels und schließlich zur Zellablösung führen kann.
Schließlich kann mit diesem Modell eine breite Palette von Assays durchgeführt werden. Zusätzlich zur Immunfluoreszenz und Mikroskopie, die in lebenden oder festen Kulturen durchgeführt wird, können die 3D-Kulturen enzymatisch verdaut werden, und die Zellen können entnommen und jeder Art von biochemischem Assay unterzogen werden. Hier demonstrieren wir die Bestimmung der ALP-Aktivität und der Quantifizierung des DNA-Gehalts in Zelllysaten mit Hilfe von kolorimetrischen/fluorometrischen Assays, aber das System ist mit vielen anderen Techniken kompatibel, einschließlich PCR, RNAseq und Proteomik. Wenn die Empfindlichkeit des gewünschten Assays nicht sehr hoch ist, kann man Proben aus mehr als einem Well zusammenfassen, um die für den Assay verfügbare Probenmenge zu erhöhen. Wenn die gewünschte Anwendung eine schnellere Gelauflösung erfordert, könnte ein orbitales Schütteln der Platte in Kombination mit kleineren Volumina der Verdauungslösung angewendet werden, um die Wirbelbildung in den Vertiefungen zu gewährleisten, vorausgesetzt, dass alle Vertiefungen auf der Platte auf diese Weise verwendet werden (lebende Kulturen reagieren empfindlich auf eine solch raue Handhabung). Zusammenfassend stellen wir hier ein Protokoll vor, das, wenn es wie beschrieben verwendet wird, die Generierung eines in vitro Modells garantiert, das die wichtigsten Aspekte osteogener vaskulärer Nischen rekapituliert, aber auch vielseitig genug ist, um für maßgeschneiderte Anwendungen modifiziert zu werden.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Riccardo Urbanet für die technische Unterstützung bei den Liquid-Handling-Geräten und Rodi Odabasi für die Unterstützung bei der Epifluoreszenzmikroskopie. Finanziert wurde diese Arbeit vom Schweizerischen Nationalfonds (Förderkennzeichen 310030E_202429 und 205321_204318) und der Ectica Technologies AG.
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
2 mL microtubes | Eppendorf | 30120094 | |
2-Amino-2-methyl-1-propanol | Sigma | A9199 | |
3DProSeed hydrogel well plate | Ectica Technologies | ECT.PS1.001.096 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma | 71768 | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533 | |
Anti-Collagen IV antibody | Abcam | ab6311 | |
Anti-Laminin 1+2 antibody | Abcam | ab7463 | |
Automated plate washer | Agilent Biotek | ELχ50 | |
Automated washer/dispenser | Agilent Biotek | MULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette | |
Bevacizumab | Evidentic | ID PS-E07-2019-00119 A009 | |
BMP-2 | Peprotech | 120-02C | |
BSA | AppliChem | A1391 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | To centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis |
Confocal laser scanning microscope | Leica | Stellaris 5 | |
Conical 50 mL centrifuge tubes | TPP | 91050 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 406406 | |
DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 405312 | |
EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
Epifluorescence microscope | Leica | DMI6000B | |
FBS | Gibco | 10500-064 | |
FGF-2 | Peprotech | 100-18B | |
Fibronectin (IST-9) | Santa Cruz | sc-59826 | |
GFP-HUVECs | PELOBiotech | PB-CAP-0001GFP | |
hBM-MSCs | – | – | Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359 |
Inverted microscope | Zeiss | 200M | |
Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
MDA-MB-231 breast cancer cell line | – | Kindly obtained from J Massagué at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | |
MEMα | Gibco | 22571-038 | |
Multimode imaging reader | Agilent Biotek | Cytation 1 | For automated imaging |
Multimode imaging reader – fluorescence and absorbance | Agilent Biotek | Cytation 5 | For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis |
Paraformaldehyde | Artechemis | US 040 | |
PBS | Gibco | 10010-015 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Phalloidin-rhodamine | Invitrogen | R415 | |
Picro-Sirius Red Solution | Abcam | ab246832 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | ThermoFisher Scientific | P7589 | |
Recombinant Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab260043 | |
SIGMAFAST BCIP/NBT | Sigma | B5655-25TAB | |
Sodium hydroxide | Sigma | 1064981000 | |
Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Sigma | S-0876 | |
Sodium phosphate monobasic, monohydrate | Merck | 1.06346 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Tween20 | AppliChem | A4974 | |
U2OS osteosarcoma cell line | – | Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich | |
α-trehalose dihydrate | Sigma | 90208 |